不同物種Sprn基因編碼區(qū)生物信息學(xué)分析

1、不同物種SPRN基因編碼區(qū)生物信息學(xué)分析葛旭升 李祥龍* 通訊作者：李祥龍，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，lixianglongcn作者簡介：葛旭升，男，1985年12月29日，碩士研究生，分子數(shù)量遺傳與動物育種郵箱：gexusheng1229，電話周榮艷 李蘭會(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071000)摘 要：對來自26個物種的70條SPRN CDS序列及其相應(yīng)氨基酸序列進行了生物信息分析。結(jié)果表明：檢測到的229個多態(tài)位點中，其中有26個單一變異位點，203個簡約變異位點。一個高度保守的N -端信號序列，精氨酸豐富的基本區(qū)域含有多達6個XXRG（其中X是G，A

2、或S）重復(fù)，20個殘基疏水區(qū)域具有較強的朊蛋白同源性。關(guān)鍵詞：SPRN基因；朊蛋白；生物信息分析 Bioinformatics analysis of SPRN gene in different speciesGe Xusheng Li Xianglong Zhou Rongyan Li Lanhui（College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei; Baoding 071000, China）Abstract: A total of 70 SPRN gene sequences with

3、the complete coding regions (CDS) and corresponding amino acid sequences belonging to 26 species were analyzed by using the software of BioEdit7.0.5 and DanSP 4.0 in order to study its genetic diversity. The results indicated that there were 229 variable sites including 26 singleton variable sites a

4、nd 203 parsimony informative sites. A highly conserved N-terminal signal sequence, Arg-rich basic region containing up to six tetra repeats of consensus XXRG (where X is G, A or S), and a hydrophobic region of 20 residues with strong homology to PrP were found.Key words：SPRN; PrP; Bioinformatics在過去十

5、年中，對朊病毒的研究已經(jīng)擴展至人類和家畜都等許多物種1。朊病毒疾病是傳染性的哺乳動物神經(jīng)退化性疾病，包括羊瘙癢病，瘋牛病和人的克雅氏病 2。SPRN是一種新的編碼Shadoo的朊病毒樣基因，是一個重要的類朊蛋白編碼基因。SPRN最初在斑馬魚研究中發(fā)現(xiàn)1，而目前SPRN已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于所有脊椎動物中4, SPRN基因被認為是在朊病毒的發(fā)病過程一個重要的候選基因1,2。在人類中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了SPRN的突變及其突變頻率與人的克雅氏存在聯(lián)系。然而，在馬、羊研究中，SPRN突變的影響尚不清楚3。通過對不同種屬旁系同源基因的分析比較研究，闡明了朊病毒生理作用，其可能對朊蛋白編碼蛋白質(zhì)的朊病毒疾病有關(guān)1。SPR

6、N具有典型的兩個外顯子朊病毒的排列，CDS完全包含在外顯子2中，此外，它有74.8可能編碼143-氨基酸蛋白和84.7與人類的朊病毒編碼相似1。本研究選用GenBank中已提交物種的SPRN基因的編碼區(qū)序列，利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法研究了該基因編碼區(qū)的變異，以期探明該基因在不同種間及種內(nèi)遺傳分化，進而為動物育種工作提供基礎(chǔ)資料。1. 材料和方法1.1 序列來源 從NCBI網(wǎng)站/的GenBank中下載26個物種的70條SPRN基因序列（表1）。表1 不同物種的SPRN基因序列來源Table 1 The source of sequenc

7、es for SPRN gene in different species物種Species序列數(shù)(Sample size)LengthStop codonGenbank Accession(基因庫序列接受號)Capra hircus(山羊)3441TAGEU939682,EU559166,EU559165Ovis aries（綿羊）18441,438, 432,420, 435TAGEU380590,EU380591,EU38592,EU595763,EU595764,EU595765,EU595766,EU595767,EU595768,EU595769,GQ174495,GQ174496

8、,GQ174497,GQ174498,GQ174499,GQ174500, DQ870545,NM001162561Orvx （羚羊）5432TAGEU596568,EU596569,EU596570,EU596571,EU596572Bos taurus（牛）5432TAGBN000839,DQ058606,DQ531936,BC148119,NM001080321Bos_grunniens（牦牛）2432TAGEU596573 ,EU605793Bos_gaurus（野牛）2432,420TAGEU605791,EU605794Cervus elaphus（麋鹿）3432TAGEU5965

9、67,EU605792,GQ149482Mouse（小鼠）4444TAGBN000519,BC056484,AJ621426,NM183147Human（人）3456TAGBN000518,BC040198,NM001012508Pan troglodytes（黑猩猩）3456TAGBN000837, XM_001146049,BN000846Dog（狗）1444TAGBN000838Oryctolagus cuniculus（家兔）1435TAGBN000843Monkey（猴）2444TAA/TAGBN001004,BN000842Apodemus sylvaticus（森林姬鼠）1444

10、TAGEU595770Norway rat(挪威鼠)2444TAGNM_001031845,BN000520Cavia porcellus(土撥鼠)1456TAGBN000844Zebrafish（斑馬魚）5399,398TGA/TAGAJ490525,NM_198981,BC162116,BC16481, BC162128Pimephales promelas（黑頭軟口鰷）1399TAABN001008Takifugu rubripes（紅鰭東方鲀）1458TAGBN000531Oryzias latipes（青鱂）1464TAGBN001007Tetraodon nigroviridis（

11、綠斑河豚）1458TAGAJ717305Gasterosteus aculeatus（三刺魚）1458TAGBN000845Gallus gallus（原雞）1354TGABN000836Myotis lucifugus(小棕蝙蝠)1435TAGBN001003Xenopus tropicalis（熱帶爪蟾）1441TAABN000841Monodelphis domestica（灰色短尾負鼠1441TAGBN0008401.2 分析方法 先利用BioEdit 軟件對70個不同序列的SPRN基因編碼區(qū)進行比對分析，選取完整編碼區(qū)序列進行比較，再利用 DanSP 5.0軟件對其進行遺傳多樣性分析

12、，生成單倍型，并計算遺傳距離。再利用MEGA4.0軟件的UPGMA方法進行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。2. 結(jié)果與分析2.1 不同物種SPRN基因核苷酸多樣性2.1.1 多態(tài)位點 在所分析的共有片段為517bp的70條序列中，發(fā)現(xiàn)229個多態(tài)位點，百分率為44.29%，其中單一多態(tài)位點26個，百分率為5.03%；簡約多態(tài)位點203個，百分率為39.26%。不同物種內(nèi)的多態(tài)位點數(shù)也各不相同。2.1.2 單倍型及其多樣性 根據(jù)序列比對，在70條SPRN基因序列中發(fā)現(xiàn)33種單倍型。核苷酸多樣性（）和平均核苷酸差異數(shù)（K）分別為0.19423和75.35965，明顯高于各物種內(nèi)（表2），說明該基因物種間分化

13、顯著。其中猴子的平均核苷酸差異數(shù)和核苷酸多樣性最高，其次是羚羊的。單倍型數(shù)最高的是綿羊，其次是羚羊，表明羚羊的SPRN基因存在較豐富的遺傳多樣性。表2 不同物種SPRN基因的單倍型多樣性Table 2 Haplotype diversity of SPRN gene in different species物種Species序列N單倍型數(shù)Np單倍型多樣性Hd平均核苷酸差異數(shù)目K核苷酸多樣性Capra hircus(山羊)320.666674.000000.01031Ovis aries（綿羊）1870.810461.254900.00323Orvx （羚羊）551.0000016.300000

14、.04201Bos taurus（牛）520.400000.400000.00103Bos_grunniens（牦牛）221.000003.000000.00773Bos_gaurus（野牛）221.000001.000000.00258Cervus elaphus（麋鹿）320.666671.333330.00344Mouse（小鼠）410.000000.000000.00000Norway rat(挪威鼠)210.000000.000000.00000Human（人）320.666670.666670.00172Monkey（猴）221.0000032.000000.08247Pan tr

15、oglodytes（黑猩猩）320.666678.666670.02234Zebrafish（斑馬魚）530.700007.200000.01856N, 序列數(shù); Np, 單倍型數(shù); Hd 單倍型多樣性; K, 平均核苷酸差異數(shù)目; , 核苷酸多樣性N, Number of sequences; Np, No. of haplotype; Hd, Haplotype diversity;K, average number of nucleotide differences; , Nucleotide diversity2.1.3 物種間核苷酸歧異度、凈遺傳距離和遺傳分化 各種群間核苷酸歧異度(

16、Dxy) 在0.0060.603之間，凈遺傳距離在0.0020.592之間，遺傳分化在0.0001.000之間(表3)，不同物種間核苷酸歧異度、凈遺傳距離和遺傳分化的變化范圍都很大，其中牛、牦牛和野牛，人和黑猩猩以及綿羊和山羊間的核苷酸歧異度、凈遺傳距離較小，說明牛、牦牛和野牛的親緣關(guān)系較近，人與黑猩猩的親緣關(guān)系較近，綿羊和山羊的親緣關(guān)系都較近，其中斑馬魚與其它物種間的核苷酸歧異度和凈遺傳距離均最大。這說明斑馬魚與本研究中其他物種間親緣關(guān)系較遠，基本上與NCBI上的動物學(xué)分類相符合。根據(jù)不同物種之間遺傳分化（Gst），用MEGA4.0 軟件的UPGMA方法構(gòu)建不同物種分子聚類圖（圖1）。根據(jù)聚

17、類圖分析得出，牛、牦牛和野牛親緣關(guān)系較近，人、黑猩猩和猴子的親緣關(guān)系較近，山羊和綿羊的親緣關(guān)系較近，斑馬魚與其他物種的親緣關(guān)系最遠，基本上與NCBI上的動物學(xué)分類相符合。表3 不同物種核苷酸歧異度、凈遺傳距離和遺傳分化Table 3 Nucleotide divergence, net genetic distance and genetic differentiation of haplotype in different species物種山羊綿羊羚羊牛牦牛野牛麋鹿小鼠挪威鼠人猴子黑猩猩斑馬魚山羊0.0140.0260.0540.0500.0470.0770.2440.2620.1860.

18、1440.1780.568綿羊0.020(0.116)0.0230.0480.0460.0440.0770.2440.2620.1870.1460.1790.577羚羊0.052(0.089)0.045 (0.055)0.0210.0200.0190.0500.2380.2540.1750.1310.1670.560牛0.057(0.308)0.050(0.17)0.043(0.18)0.0020.0040.0660.2620.2830.1970.1540.1870.590牦牛0.059(0.098）0.052(0.099)0.045(0.031）0.006(0.148）0.0030.0640

19、.2600.2810.1930.1510.1830.582野牛0.054(0.098）0.047(0.099）0.041(0.031）,0.006(0.198）0.008(0.000）0.0620.2580.2780.1930.1500.1850.585麋鹿0.084(0.200)0.081(0.116)0.073(0.089)0.069(0.308)0.070(0.098)0.065(0.098)0.2530.2660.1910.1510.1810.592小鼠0.249(0.534)0.246(0.230)0.259(0.308)0.262（0.640)0.264(0.407)0.259(0

20、.407)0.254(0.534)0.0570.2060.1690.2500.589挪威鼠0.267(0.447)0.264(0.191)0.275(0.241)0.283(0.540)0.285(0.333)0.280(0.333)0.267(0.447)0.057(1.000)0.2240.1880.2220.586人0.192(0.200)0.190(0.116)0.197(0.089)0.199(0.308)0.198(0.0978)0.196(0.098)0.193(0.200）0.207(0.534）0.225(0.447）0.0180.0040.575猴0.190(0.098）0

21、.189(0.099）0.194(0.031）0.195(0.198）0.196(0.000）0.192(0.000）0.194(0.098）0.210(0.407）0.230(0.333）0.060(0.098）0.0130.532黑猩猩0.195(0.200）0.192(0.116）0.199(0.089）0.199(0.308）0.198(0.098）0.197(0.098）0.194(0.200）0.217(0.534）0.233(0.447）0.016(0.200）0.065(0.098）0.564斑馬魚0.583(0.183)0.587(0.112)0.590(0.081)0.60

22、0(0.290)0.598(0.099）0.595(0.099）0.603(0.183）0.599(0.453）0.595(0.360）0.5855(0.183）0.583(0.099）0.585(0.183）上三角為凈遺傳距離(Da)，下三角為核苷酸歧異度(Dxy)和遺傳分化（Gst）（括號內(nèi)）Above diagonal is net genetic distance(Da)；below diagonal is nucleotide divergence(Dxy) and genetic differentiation of haplotype（Gst）(in bracket)圖1 根據(jù)物

23、種間的遺傳分化構(gòu)建的聚類圖Figure.1 Phylogenetic tree based on genetic differentiation of species2.2 不同物種SPRN氨基酸多樣性分析 不同物種70條 SPRN基因序列編碼區(qū)中同義替換平均位點數(shù)為60.09個，非同義替換平均位點數(shù)為152.91個。不同物種同義替換位點數(shù)(SS)為51.1762.17(表4），同義替換核苷酸多樣性均值(s)為0.36647。非同義替換位點數(shù)（NSS）為150.83157.40，非同義替換核苷酸多樣性均值(a)為0.20448。綿羊的非同義替換位點數(shù)較其它物種多，說明綿羊SPRN基因編碼區(qū)的非

24、同義替換較其它物種高。表4 不同物種SPRN基因同義替換和非同義替換Table 4 Synonymous and nonsynonymous substitution of SPRN gene in different speciesSpecies（物種）同義替換位點數(shù)(SS)非同義替換位點數(shù)(NSS)Capra hircus(山羊)60.72152.28Ovis aries（綿羊）60.34152.67Orvx （羚羊）51.17151.60Bos taurus（牛）60.33152.67Bos_grunniens（牦牛）60.17152.84Bos_gaurus（野牛）60.33152.6

25、7Cervus elaphus（麋鹿）60.56152.44Mouse（小鼠）61.67151.33Norway rat(挪威鼠)62.17150.83Human（人）60.33152.67Monkey（猴）60.92152.08Pan troglodytes（黑猩猩）60.83152.17Zebrafish（斑馬魚）55.60157.40SS, 同義替換位點數(shù); NSS, 非同義替換位點數(shù); SS, Synonymous sites; NSS, Nonsynonymous sites2.3 氨基酸序列結(jié)構(gòu)功能域分析 SPRN的基因，編碼Shadoo朊蛋白,它與蛋白質(zhì)的同源性和朊蛋白的某些功能

26、有關(guān)5。對43條氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)SPRN基因編碼氨基酸序列中含有一個高度保守的N -端信號序列，精氨酸豐富的基本區(qū)域含有多達6個XXRG（其中X是G，A或S）重復(fù)，20個殘基疏水區(qū)域具有較強的朊蛋白同源性，并含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。以山羊氨基酸序列EU939682和斑馬魚氨基酸序列BC164818分別作為哺乳動物和非哺乳動物代表比對兩大類動物間的結(jié)構(gòu)差異（見圖2），發(fā)現(xiàn)哺乳動物低復(fù)雜性區(qū)域明顯多于非哺乳動物，這可能是因為變異蛋白在一定區(qū)域內(nèi)更傾向于反復(fù)使用一種氨基酸，而原始蛋白的這種傾向較弱6。 圖2 氨基酸序列EU939682結(jié)構(gòu)功能域分析 氨基酸序列BC164818結(jié)構(gòu)功能域 (注：

27、加粗部分表示低復(fù)雜性區(qū)域)3. 分析討論研究結(jié)果表明，不同物種間的核苷酸歧異度、凈遺傳距離和單倍型間的遺傳距離均較大，這說明不同物種間遺傳分化已經(jīng)十分明顯。從不同物種的70條SPRN基因序列構(gòu)建的聚類圖中可看到山羊，綿羊，牛類，麋鹿和羚羊之間親緣關(guān)系較近，與動物分類一致。我們可以發(fā)現(xiàn)魚和哺乳動物的SPRN為同源基因，并有較高的保守區(qū)。但是，它們的DNA序列存在分歧，這表明四足動物和魚的基因可能有顯著不同的功能7。 本研究中發(fā)現(xiàn)，所選物種的SPRN基因的非同義替換位點數(shù)均明顯高于同義替換位點數(shù)，說明所分析的這兩個種群進化過程中可能受到正選擇的影響8。物種間的SPRN基因有229個突變位點，這些突

28、變位點是否與不同物種動物的朊蛋白疾病發(fā)生有關(guān)還需要進一步研究，在某些物種內(nèi)發(fā)現(xiàn)僅生成一種單倍型，除了由于SPRN基因編碼區(qū)在物種內(nèi)較保守的原因外，可能還與這些物種樣本含量太小有關(guān)。參考文獻：1 Uboldi C, Paulis M, Guidi E, et al, Cloning of the bovine prion-like Shadoo (SPRN) gene by comparative analysis of the predicted genomic locus J. Mammalian Genome, 2006; 17(11):1130-1139.2 Lloyd SE, Grizenkova J, Pota H, Collinge J, Shadoo (SPRN) and prion disease incubation time in mice. Mamm Genome J. Mammalian Genome, 2009;20(6): 367-