血吸蟲抗體快速檢測試劑盒綜述資料

1、血吸蟲抗體快速檢測試劑盒的綜述資料1、 產(chǎn)品預(yù)期用途1.1產(chǎn)品預(yù)期用途：血吸蟲抗體快速檢測試劑盒（斑點(diǎn)免疫金滲濾法）簡稱試劑盒，是用于體外定性人血清中是否有血吸蟲抗體，是用于診斷血吸蟲病的依據(jù)，也是血吸蟲病預(yù)防控制的基礎(chǔ)、流行病學(xué)調(diào)查的工具、疫情監(jiān)測的手段。1.2與預(yù)期用途有關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況：血吸蟲病免疫學(xué)診斷方法是十分可靠的輔助診斷依據(jù)，也是流行病學(xué)調(diào)查最常用的工具。1.3相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法及產(chǎn)品現(xiàn)狀等：血吸蟲病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的流行性傳染病，發(fā)展有效的診斷篩查方法能促進(jìn)血吸蟲病流行的預(yù)防控制工作。國內(nèi)外已建立用于血吸蟲病診斷的病原學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等多種方法，病原學(xué)

2、診斷方法（糞便查蟲卵）由于敏感性較低，分子生物學(xué)方法（如PCR）需要特殊的儀器設(shè)備，均難以在流行區(qū)現(xiàn)場推廣。目前，常用的血吸蟲病現(xiàn)場篩查方法仍以免疫學(xué)方法為主，如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、環(huán)卵沉淀（COPT）、間接血凝（IHA）。 隨著現(xiàn)代免疫理論和技術(shù)的進(jìn)步，免疫學(xué)檢測技術(shù)得到了不斷發(fā)展和更新，快速簡便，易于操作的免疫學(xué)診斷方法更易于被醫(yī)技人員，尤其是現(xiàn)場防治人及患者所接受。上海疾控生物科技有限公司生產(chǎn)的“血吸蟲抗體快速檢測試劑盒”操作簡便，不需要使用儀器設(shè)備，結(jié)果易于判讀，適合于各級醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)及現(xiàn)場血吸蟲病防治人員使用。此方法納入了中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 血吸蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS2

3、61-2006）目前國內(nèi)外尚無類似產(chǎn)品。2、產(chǎn)品描述2.1 產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理：氯金酸(HauCI )在還原劑的作用下可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液稱膠體金。膠體金顆粒表面帶有負(fù)電荷與蛋白質(zhì)等生物大分子的正電荷基團(tuán)因靜電作用形成牢固結(jié)合，而蛋白質(zhì)的生物活性無明顯的改變。當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)。2.1.1血吸蟲抗體試劑盒測定原理：斑點(diǎn)免疫金滲濾法（Development of dot immunogold filtration assay，DIGFA)是以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜的可濾過性和毛細(xì)管作用，使抗原抗體反應(yīng)在一個(gè)特殊的滲

4、濾裝置上，以液體滲濾過膜的方式迅速完成。滲濾裝置為一充滿吸水墊料的塑料小盒，在盒蓋中央的小孔下面放置了一片硝酸纖維素膜，膜上預(yù)包被血吸蟲抗原斑點(diǎn)，試驗(yàn)時(shí)將血清滴加在膜上，通過滲濾使抗原抗體在膜上發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，然后滴加金標(biāo)結(jié)合物，使其與對應(yīng)的抗體結(jié)合并顯色，陽性結(jié)果在膜上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，反之，則為陰性結(jié)果。斑點(diǎn)顏色的深淺相應(yīng)地提示陽性強(qiáng)度。2.1.2試劑盒產(chǎn)品的組成：試劑盒是由檢測盒、洗滌液、顯色液組成。檢測盒為ABS 材料制成的一個(gè)白色帶孔塑料盒，塑料盒孔內(nèi)的濾膜上包被有點(diǎn)狀可溶性血吸蟲抗原的檢測點(diǎn)及人IgG的質(zhì)控點(diǎn)。 洗滌液由TBS、吐溫20組成。顯色液由氯金酸、鞣酸-檸檬酸鈉、羊抗人Ig

5、G組成。2.1.3測定主要參數(shù)試驗(yàn)方法：將試劑盒取出，置于室溫下回暖，編號；在檢測盒中央小孔內(nèi)滴加2滴洗滌液，滲入后于反應(yīng)板中央加25 l 受檢血清，待液體充分吸入，加2滴洗滌液，滲入后加4滴顯色液，最后加2滴洗滌液，滲入后即可判斷結(jié)果。出現(xiàn)兩個(gè)紅色斑點(diǎn)為陽性，出現(xiàn)一個(gè)紅色斑點(diǎn)為陰性，無斑點(diǎn)表示結(jié)果無效。（洗滌液與顯色液每滴約為40ul）2.2 主要原材料來源及制備方法2.2.1 產(chǎn)品的組成 洗滌液 TBS、吐溫20 顯色液 氯金酸、鞣酸-檸檬酸鈉、羊抗人IgG 檢測點(diǎn)試液 0.2 mg/ml 質(zhì)控點(diǎn)試液 0.01mol2.2.2主要原料的規(guī)格來源 洗滌液 外購 顯色液 外購 【由上海市疾病預(yù)

6、防控制中心提供】 檢測點(diǎn)原料 外購 【由上海市疾病預(yù)防控制中心提供】 檢測點(diǎn)試液 自制 質(zhì)控點(diǎn)試液 自制 塑料盒 定制 吸水紙 符合GB/T 20808-2006 外購 【國產(chǎn)】 硝酸纖維素膜 外購 【進(jìn)口】2.2.3主要原料的制備方法2.2.3.1血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA）（試劑盒檢測點(diǎn)原料）（1）制備方法：取人工感染1500條日本血吸蟲尾蚴45d的家兔肝臟，用生理鹽水洗凈后經(jīng)高速搗碎機(jī)搗碎，分樣篩分離除去肝臟組織，沉淀離心，收集分離蟲卵，依次經(jīng)200目和300 目尼龍絹過濾，收集濾渣，即為較純凈的血吸蟲蟲卵。然后加入10倍量的生理鹽水，置玻璃勻漿器內(nèi)制成勻漿，用超聲粉碎機(jī)超聲處理（1m

7、in10次），液氮凍融3次，最后以10 000 r/ min 離心30 min ，上清液即為血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA），經(jīng)0.22um超濾膜過濾除菌后分裝，20凍存?zhèn)溆?。?）工作濃度：SEA 的作用是作為檢測點(diǎn)，包被于硝酸纖維素膜上，用于檢測人血清中特異性抗血吸蟲抗體。因此，其工作濃度的選擇對于檢測效果的評價(jià)是試劑盒研制的關(guān)鍵技術(shù)。如果濃度過高，陽性反應(yīng)色度過強(qiáng)，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果；反之，濃度過低，則不易辨別，影響檢測的靈敏度2.2.3.2金標(biāo)二抗（試劑盒顯色液原料）（1）制備方法：a. 膠體金制備采用鞣酸-檸檬酸鈉還原法，膠體金顆粒直徑為20 nm。具體方法為：取1%氯金酸5ml溶于39

8、5 ml dH2O，加熱至60 ，快速加入鞣酸-檸檬酸鈉溶液100 ml（1%檸檬酸三鈉20 ml，1%鞣酸0.05 ml，dH2O 80 ml），加熱煮沸15 min，溶液顏色由黑逐漸變?yōu)榱良t色。冷卻后用0.1 mol/L碳酸鉀調(diào)溶液pH至8.0。金標(biāo)二抗制備二抗為親和層析法純化的羊抗人IgG(上海神航生物科技有限公司，蛋白濃度為3.34mg/ml，批號：IP2030)。最適蛋白穩(wěn)定量選擇：將待標(biāo)記的二抗分別加到 1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對照管，分鐘后加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置小時(shí)觀察結(jié)果，紅色不變者為能使膠體金穩(wěn)定的蛋白量，再加20即為最適標(biāo)記蛋白量。2.

9、2.2.3 人IgG（試劑盒質(zhì)控點(diǎn)原料）（1）制備方法：采用辛酸提純法從健康獻(xiàn)血者血清中提取人IgG。經(jīng)0.22um超濾膜過濾除菌后分裝，2ul/支，置凍干機(jī)抽成干粉，-20保存。臨用時(shí)每支加工作濃度的PBS復(fù)溶即可。（2）工作濃度：人IgG的作用是作為質(zhì)控點(diǎn)，包被于硝酸纖維素膜上，能夠與金標(biāo)二抗結(jié)合，產(chǎn)生紅色圓點(diǎn)，以此判斷金標(biāo)二抗處于有效期內(nèi)；如不能出現(xiàn)紅色圓點(diǎn)，則金標(biāo)二抗失效。因此，試驗(yàn)?zāi)康木褪沁x擇能清晰產(chǎn)生反應(yīng)色度的人IgG濃度。2.2.2.4說明上述原料均系上海市疾病預(yù)防控制中心作為本產(chǎn)品技術(shù)成果轉(zhuǎn)化的配套提供給本公司。2.3 主要生產(chǎn)工藝過程2.3.1 試液（顯色液、洗滌液）分裝：準(zhǔn)

10、備分裝清場確認(rèn)2.3.2試劑盒： 準(zhǔn)備吸水紙折疊塑料盒組裝試劑溶液（檢測點(diǎn)試液、質(zhì)控點(diǎn)試液）配制檢測點(diǎn)質(zhì)控點(diǎn)包被內(nèi)包裝清場確認(rèn)2.3.3 外包裝： 準(zhǔn)備試液、試劑盒、標(biāo)簽質(zhì)量判定外包裝清場確認(rèn)2.3.4 產(chǎn)品生產(chǎn)的工藝環(huán)境控制 為保證試劑盒產(chǎn)品的穩(wěn)定，本公司按試劑生產(chǎn)管理相關(guān)法規(guī)規(guī)定，對產(chǎn)品生產(chǎn)過程的環(huán)境實(shí)施了凈化（10萬級）控制措施，并建立實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)的追溯管理，以保證產(chǎn)品的使用性能，在符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的同時(shí)，滿足臨床檢測篩選診斷的精度要求。2.4 質(zhì)控品的制備方法及溯源情況 本公司的質(zhì)控品用途是對產(chǎn)品出廠前的性能檢測，由上海市疾病預(yù)防控制中心在提供檢測點(diǎn)試液時(shí)配套提供，進(jìn)廠入庫前均由上海

11、市疾病預(yù)防控制中心出具檢驗(yàn)報(bào)告。本質(zhì)控品是參照“血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品” （中國藥品生物制品檢定所 批號：20041108）低感染度抗體水平(P13)制備，作為斑點(diǎn)免疫金滲濾法血吸蟲抗體陽性臨界值參照。3、生物安全性及廢品處理血吸蟲抗體快速檢測試劑盒（斑點(diǎn)免疫金滲濾法）主要成分是血吸蟲蟲卵抗原及人IgG，是生物活性蛋白，在生物活性傳染性物質(zhì)名錄中，血吸蟲抗原和人IgG沒有被列入其中。同時(shí)，經(jīng)過上海市疾病預(yù)防控制中心多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，均無生物污染及危害性。一旦不慎濺入眼睛，可立即用水沖洗。試劑用塑料瓶裝外用紙盒打箱，基本無泄漏，運(yùn)輸中不會污染環(huán)境，塑料瓶和紙箱由醫(yī)院按醫(yī)療垃圾處理。醫(yī)院在檢

12、驗(yàn)過程中使用的血清標(biāo)本，則按醫(yī)院管理的相關(guān)制度執(zhí)行滅活處理。4、產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價(jià)4.1 主要研究結(jié)果的總結(jié) 膠體金斑點(diǎn)免疫滲濾法是上世紀(jì)90年代以來我國血吸蟲病免疫診斷上新出現(xiàn)的方法，其優(yōu)勢在于操作簡便、反應(yīng)快速，不需任何專門設(shè)備，不需工作人員特殊培訓(xùn)，既可用于大規(guī)模血清流行病學(xué)調(diào)查，又能作為單份檢測個(gè)別病例的免疫學(xué)診斷工具。經(jīng)中國科學(xué)院上?？萍疾樾伦稍冎行脑u價(jià)，綜合技術(shù)在國內(nèi)處于領(lǐng)先，并達(dá)到國際先進(jìn)水平。因此本公司在 2008 年引進(jìn)了由上海疾控中心的研制成果，膠體金斑點(diǎn)免疫滲濾法的血吸蟲抗體快速檢驗(yàn)試劑盒的生產(chǎn)技術(shù)，并經(jīng)產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)換，已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的完備，產(chǎn)品的定型標(biāo)準(zhǔn)化以及

13、臨床適用性的驗(yàn)證工作。使之成為具有臨床實(shí)際使用意義的醫(yī)療器械篩選類試劑。4.2 對試劑盒的評價(jià)4.2.1 性能分析評價(jià)根據(jù)最佳條件組成的試劑盒對血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品的測試結(jié)果，顯示出陰、陽性參考品的檢測符合率均高于90 %，靈敏度為1:4，精密度測試10次均為陽性，顯色均勻一致，均符合國家參考品的檢測質(zhì)量要求（表1）。表1 血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品的測試結(jié)果Table1. Results of detecting the national reference IgG serum of schistosomiasis by dot immunogold filtration as

14、say（DIGFA）kit.血清Sera份數(shù)No. sera 陰性(數(shù))No. negative陽性(數(shù))No. positive符合率（%）Coincident rates陰性參考品Negative reference sera15150100陽性參考品Positive reference sera15015100靈敏度參考品Detectable minimum reference sera4(1:21:16)2（1:8；1:16）2 (1:2；1:4)1:4精密度參考品Precision reference sera10010100血吸蟲病抗體強(qiáng)度依次為、+、+、+The intensit

15、y of antibody to schistosomiasis is 、+、+、+, respectively.圖1 金標(biāo)滲濾法檢測血吸蟲病抗體強(qiáng)度效果圖 Fig.1 Results of detecting the intensity of antibody to schistosomiasis by dot immunogold filtration assay（DIGFA）4.2.2穩(wěn)定性：試劑盒在穩(wěn)定性及加速破壞性實(shí)驗(yàn)中，對15份陽性參考血清和15份陰性參考血清及靈敏度、精密度檢測血清的檢測結(jié)果表明：從加速破壞性實(shí)驗(yàn)來看，試劑盒在37保存5天后，陽性檢出率和陰性檢出率可保持不變，靈敏

16、度高于1：4，精密度好；4條件下保存180天后，陽性檢出率和陰性檢出率保持不變，靈敏度高于1：4，精密性好。且兩者陽性反應(yīng)的強(qiáng)度均未見減弱。4.2.3現(xiàn)場效果測評4.2.3.1 設(shè)計(jì)方案：根據(jù)臨床研究方案要求，本臨床試驗(yàn)以2種糞檢（Kato-Katz法和毛蚴孵化法）結(jié)果作為血吸蟲病陽性診斷金標(biāo)準(zhǔn)，以無血吸蟲感染史、無血吸蟲疫水接觸史且糞檢結(jié)果陰性作為血吸蟲陰性診斷金標(biāo)準(zhǔn)，在流行區(qū)篩選血吸蟲病患者（金標(biāo)準(zhǔn)陽性）和非流行區(qū)選擇陰性對照者（金標(biāo)準(zhǔn)陰性）作為臨床試驗(yàn)對象。試驗(yàn)對象總數(shù)不少于1000例，按要求采集試驗(yàn)對象的血清樣本。在各實(shí)驗(yàn)室將所有血清樣本（陽性和陰性）次序混和后重新隨機(jī)排列、分別將血清

17、吸入新編次序的血清管中制備成血清盤，由統(tǒng)計(jì)人員管理原始編號和新編號信息。由經(jīng)過培訓(xùn)的操作人員用血吸蟲抗體快速檢測試劑盒對血清盤進(jìn)行檢測和結(jié)果判斷，整個(gè)試驗(yàn)中對臨床試驗(yàn)的操作人員和結(jié)果判斷者實(shí)行雙盲，試驗(yàn)結(jié)束后由統(tǒng)計(jì)人員將檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果進(jìn)行比較分析，計(jì)算血吸蟲抗體快速檢測試劑盒的陽性符合率（敏感性）和陰性符合率（特異性）等指標(biāo)。4.2.3.2 現(xiàn)場測評結(jié)果本次臨床實(shí)驗(yàn)共收集1132份血清，采用上海疾控生物科技有限公司的試劑盒與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行同步盲法檢測；運(yùn)用靈敏度、特異度、調(diào)整一致性、約登指數(shù)這幾個(gè)指標(biāo)對該診斷試劑進(jìn)行評價(jià)。 檢驗(yàn)結(jié)果見下表:診斷試劑 敏感度 特異度 調(diào)整一致性 約登指數(shù)

18、試劑盒 94.2% 97.2% 93.7% 0.912 從上述表中可以看出，試劑盒靈敏度較高，與病原學(xué)陽性的血清檢測結(jié)果基本一致。 采用調(diào)整一致性、約登指數(shù)進(jìn)行分析，說明試劑盒檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果之間具有較好的真實(shí)性，對判斷陽性和陰性結(jié)果具有較強(qiáng)的準(zhǔn)確性。能夠準(zhǔn)確鑒別具有患病人群和正常人群能力。4.3 結(jié)論：上海疾控生物科技有限公司生產(chǎn)的血吸蟲抗體快速檢測試劑盒（斑點(diǎn)免疫金滲濾法）。具有以下特點(diǎn)1. 快速：全部檢測過程僅需1-2分鐘。2. 簡便：不需其它任何儀器設(shè)備，操作也極其簡單，可隨時(shí)隨地進(jìn)行。3. 可單份檢測：對標(biāo)本既能成批檢測，又可單份檢測，患者可立刻拿到結(jié)果，不必等待。4. 高敏感性和特異性該試劑盒不存在放射性危害可以在臨床檢驗(yàn)及疫區(qū)血防所進(jìn)行大規(guī)模篩查使用，為日本血吸蟲病的診斷和治療提供有效的依據(jù)。5、其他本產(chǎn)品是上海市疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病研究室多年研究的成果，作為技術(shù)成果轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，由上海疾控生物科技有限公司按體外診斷