第八章分光光度分析、電化學(xué)分析及自動(dòng)化技術(shù)

1、第五章 常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)臨床生化檢驗(yàn)常用的分析技術(shù)有光譜分析技術(shù)、電化學(xué)分析技術(shù)、電泳分析技術(shù)、層析和離心分析技術(shù)及自動(dòng)化分析技術(shù)。其中光譜分析技術(shù)是最基本和最常用的技術(shù)，它具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡便、選擇性好等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)吸收或發(fā)射輻射能而建立起來的一類分析方法，因不同分子的原子團(tuán)和原子，其發(fā)射光譜和吸收光譜不同，而相同的物質(zhì)在一定條件下，其發(fā)射光譜和吸收光譜的強(qiáng)度與該物質(zhì)的含量成正比關(guān)系。因此可對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，此類技術(shù)稱為光譜技術(shù)。是一種最常用的生化檢驗(yàn)測定技術(shù)，它主要包括吸收光譜（可見紫外、紅外原子吸收光譜法）、發(fā)射光譜（熒光法、

2、火焰發(fā)射光譜法）和散射光譜（比濁法）。光是一種高速傳播的電磁輻射，具有波、粒二象性，光的波長（）的常用單位納米（nm），可見光波長400760nm，400nm稱為紫外光，760nm稱為紅外光，波長愈短，能量愈大。可見，紫外吸收光譜是由于多原子分子的價(jià)電子在電磁輻射的作用下，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，這種因物質(zhì)分子對輻射的選擇性吸收而得到的光譜稱為吸收光譜。處于高能態(tài)的分子（激發(fā)態(tài)分子）是不穩(wěn)定的，當(dāng)返回基態(tài)時(shí)，便發(fā)射出相應(yīng)的光譜，稱為發(fā)射光譜?？梢姡贤馕展庾V用于定量分析的依據(jù)是光的吸收定律，即Lambert-Beer是律，它是吸收光譜法的基本定律。一、分光光度法的基本原理（一）吸光度與透光度當(dāng)光

3、線通過均勻、透明的溶液時(shí)，一部分光被散射，一部分光被吸收，另一部分光透過溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為Io，透射光強(qiáng)度為It，It與Io之比稱為透光度（T），即T常用百分?jǐn)?shù)表示（T%），也稱為百分透光度。透光度的負(fù)對數(shù)稱為吸光度（A），又稱為消光度（E），光密度（OD），即吸光度與透光度的換算：如透光度=10時(shí)A = lg100lg10 = 21 = 1透光度=20時(shí)A = lg100lg20 = 21.3 = 0.7（二）Lambert-Beer定律1. Lambert定律 當(dāng)一束強(qiáng)度為Io的單色光透過某種吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，則透過的光線為It。當(dāng)溶液濃度不變時(shí)，透過的液層愈厚，則光線

4、強(qiáng)度的減弱愈顯著。吸光度隨液層厚度增加而增加，其關(guān)系是吸光度（A）與液層厚度成正比，即將上述比例式寫成等式，則引入比例常數(shù)，即吸光系數(shù)（K），得A = KL當(dāng)溶液濃度不變時(shí)，吸光度與液層厚度成正比，這就是Lambert定律。2. Been定律 當(dāng)一束強(qiáng)度為Io的單色光透過某種吸光溶液后，若液層厚度不變，而濃度不同時(shí)，溶液的濃度愈大，則透過光的強(qiáng)度愈弱，其定量關(guān)系是：當(dāng)液層厚度不變時(shí)，吸光度與溶液濃度成正比，這就是Beer定律。合并Lambert定律和Beer定律即Lambert-Beer定律 是說明吸光物質(zhì)對單色光吸收的強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度和液層厚度成正比。溶液的吸光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系，如用坐標(biāo)表

5、示，即A-C曲線 呈正比 易制圖，使用方便（三）吸光系數(shù)吸光系數(shù)K的物理意義是吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度，在給定條件下（波長、溶液性質(zhì)、濃度）吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)，K值愈大，能測定的濃度C愈小，則靈敏度愈高。吸光系數(shù)的表示方法mol1cm1. 摩爾吸光系數(shù) 用 表示，其意義是濃度為1mol的溶液在厚度為1cm時(shí)的吸光度。2. 百分吸光系數(shù) 或稱比吸光系數(shù)，用表示，是指濃度為1（W/V）的溶液在厚度為1cm時(shí)的吸光度。換算關(guān)系：二、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)由光源、單色光器、比色杯、光電管、運(yùn)算放大器和顯示器等部分組成。1.光源 2.單色光器 3.試樣室 4.光電管 5.運(yùn)算

6、放大器 6.顯示器圖5-1 分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖（一）光源可見光分光光度計(jì)常用光源是鎢燈，能發(fā)射出350nm2500nm波長范圍的連續(xù)光譜，適用范圍是360nm1000nm。現(xiàn)常用的是鹵鎢燈，發(fā)光效率提高，使用壽命延長。紫外分光光度計(jì)常用光源是氫燈，其發(fā)射波長范圍為150nm400nm。（二）單色光器將光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為單色光器。常用的單色光器有濾光片、棱鏡和光柵。（三）比色杯盛放比色溶液的裝置。用無色透明、耐腐蝕、耐酸堿的玻璃或石英材料做成。光徑有0.55cm，比色杯間的透光度誤差應(yīng)小于0.5%。（四）檢測器由光電管和運(yùn)算放大器組成，是將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，并將電信號放大的裝

7、置。（五）顯示器是將檢測器所檢測的電流通過儀表顯示出來的裝置。常用的有檢流計(jì)和數(shù)字顯示器。檢流計(jì)可顯示透光度（T%）和吸光度（A），數(shù)字顯示器可顯示T%、A和C（濃度）。三、分光光度法的定量方法1. 對比法 又稱標(biāo)準(zhǔn)對照法，通常在測定未知濃度樣品的同時(shí)，測定一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液作比較，然后分別測定兩者的吸光度。 因測定成分相同，故a值相同，比色時(shí)用同樣規(guī)格的比色皿故bS=bR，所以比色分析中測定標(biāo)準(zhǔn)液與未知液吸光度的比值也就等于其濃度的比值，即 若標(biāo)準(zhǔn)液與樣品用量不等時(shí)，則再乘上。用對比法進(jìn)行定量時(shí)，為了減少誤差，選用標(biāo)準(zhǔn)液濃度應(yīng)盡可能接近待測樣品濃度。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)

8、液，按一定操作方法顯色后，用選定的波長分別測定它們的吸光度，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上標(biāo)出各坐標(biāo)點(diǎn)，通過原點(diǎn)連接各點(diǎn)應(yīng)成一直線，即A-C曲線。注意事項(xiàng)：（1）應(yīng)設(shè)置56個(gè)濃度。（2）設(shè)置的濃度范圍應(yīng)足夠大，直至觀察到“拐點(diǎn)”（即不呈直線的濃度值），或到能滿足臨床應(yīng)用的濃度為止，以便能準(zhǔn)確地劃出線性范圍。（3）每一種濃度最好是做三個(gè)平行測定，并要求3支平行管吸光度的最大值與最小值之差應(yīng)小于0.05，然后求平均值。（4）校正 有時(shí)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線C與A相交的點(diǎn)不一定完全在一條直線上，定線時(shí)若采用目測法校正，如校正不當(dāng)，反面會造成更大的誤差，科學(xué)的方法采用直線回歸方程來確定直

9、線的位置，其計(jì)算方式是 y = a + bx四、其它光譜分析技術(shù)（一）火焰光度法是一種發(fā)射光譜分析法，是利用火焰使金屬元素激發(fā)后，能發(fā)射出特征性譜線的特點(diǎn)進(jìn)行測定的一種方法1. 基本原理 某些金屬元素的基態(tài)原子受到火焰的激發(fā)后，其外層電子獲得能量而從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，接著它們又以發(fā)射光譜的形式釋放出所獲得的能量，而返回基態(tài)，在相同條件下，同一元素所釋放的單位能量相同，故能形成固定光譜。而不同的元素受激發(fā)后所發(fā)射光譜不同。如鈉發(fā)射光譜波長589nm，鉀發(fā)射光譜波長767nm由于火焰供給的能量不強(qiáng)，只能激發(fā)堿金屬和堿土金屬元素，生化檢驗(yàn)中常用于鉀、鈉的測定。元素的發(fā)射譜線強(qiáng)度與該元素濃度的關(guān)系可表

10、示為：I = acba是與試樣組成、及其蒸發(fā)和激發(fā)過程有關(guān)的常數(shù)，b為自吸收系數(shù)，在濃度很低時(shí)，b1，所以上式可寫成I = ac，即發(fā)射譜線強(qiáng)度與待測元素濃度成正比。2. 火焰光度計(jì)的基本構(gòu)造 基本結(jié)構(gòu)主要分三個(gè)部分：激發(fā)光源系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測顯示系統(tǒng)（二）熒光分析法暗利用某些物質(zhì)受紫外光照射后發(fā)出特有的熒光，籍此對物質(zhì)進(jìn)行定性，定量分析的方法。1. 基本原理 某些物質(zhì)的分子吸收了光能，從基態(tài)躍遷至某一電子激發(fā)態(tài)中的某一振動(dòng)能級，處于激發(fā)態(tài)較高振動(dòng)能級中的分子通過運(yùn)動(dòng)或與其他分子的碰撞而將過多的能量轉(zhuǎn)給其他分子，并返回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級，然后發(fā)生自發(fā)輻射，躍遷到基態(tài)，發(fā)射一定波長的輻

11、射能，此能量即熒光，熒光多為可見光，在一定濃度范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度與溶液濃度呈線性關(guān)系，是量關(guān)系式可表示為：F=f Iobc = KcK為常數(shù)，它與物質(zhì)的性質(zhì)，激發(fā)光強(qiáng)度、波長、液層厚度等條件有關(guān)。此公式是熒光分析的定量基礎(chǔ)，但它只適合于稀溶液，即bc項(xiàng)不大于0.05，因此線性范圍的最大濃度為Cmax =。當(dāng)溶液濃度超過Cmax時(shí)，熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性的。2. 影響熒光強(qiáng)度的因素（1）溫度、pH T，分子碰撞頻率，因此熒光強(qiáng)度隨溫度升高而減弱。pH可影響化合物電離或使熒光物質(zhì)水解，如苯胺在pH712溶液中主要的分子形式存在，產(chǎn)生藍(lán)色熒光，而在Ph2或13的溶液中以離子形式存在，不能產(chǎn)生熒光。（

12、2）激發(fā)光和發(fā)射光 在定量測定時(shí)，一般應(yīng)選擇熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長（ex）和最大熒光波長（em），但有些熒光物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，受激發(fā)光照射后易分解，縮短樣品照射時(shí)間，改變激發(fā)光波長。（3）物質(zhì)濃度的影響 熒光分析只適合稀溶液，因熒光物質(zhì)濃度高，分子間碰撞增加，使熒光強(qiáng)度減弱，這種現(xiàn)象稱為自熄滅，自熄滅現(xiàn)象隨濃度增加而增強(qiáng)。3. 儀器與測定方法 作為熒光分析的儀器有光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)。光電熒光計(jì)的結(jié)構(gòu)與光電比色計(jì)很相似，不同之處是檢測器與光線成直角，并多一塊濾光片。如將濾光片改為棱鏡或光柵作單色器，就和可見紫外分光光度計(jì)相似而成熒光分光光度計(jì)。四類儀器的組成部件的比較光 源單色器測定池

13、光敏元件檢測器光電比色計(jì)鎢 燈濾光片玻 璃（二面透光）光電池光電管檢流計(jì)光電熒光計(jì)鹵鎢燈（300-700nm）兩 塊濾光片玻 璃（四面透光）光電管檢流計(jì)可見、紫外分光光度計(jì)鎢燈（400-760nm）氫燈（200-400nm）光 柵或棱鏡玻 璃石 英光電管光電倍增管自 動(dòng)記錄儀熒光分光光度計(jì)氙弧燈（200-700nm）光 柵或棱鏡玻 璃石 英光電倍增管自 動(dòng)記錄儀氙弧燈發(fā)射的強(qiáng)烈紫外線對人眼有害。熒光分析優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高 比可見紫外吸收光譜高103104倍。（2）特異性強(qiáng) 通過選擇合適的激發(fā)光波長和熒光波長可避開其它物質(zhì)干擾。（3）操作簡便、快速、重現(xiàn)性好。（4）樣品用量少不足之處：（1）應(yīng)

14、用范圍有一定局限性，因許多物質(zhì)不能產(chǎn)生熒光。（2）對測定條件要求嚴(yán)格，如試劑、溶劑不應(yīng)含有熒光雜質(zhì)。（3）儀器價(jià)格較貴熒光分析法在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中可用于測定類固醇激素（腎上腺皮質(zhì)激素、性激素）及代謝產(chǎn)物，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（幾茶酚胺，5-HT），某些維生素（VitA、B族）。（三）原子吸收分光光度分析 屬吸收光譜分析1. 基本原理：待測元素經(jīng)原子蒸氣發(fā)生器轉(zhuǎn)化成氣態(tài)原子（處于基態(tài)），由空心陰報(bào)燈提供的待測元素的其振線經(jīng)過待測元素的蒸氣，共振輻時(shí)強(qiáng)度被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子吸收而減弱，其吸收規(guī)律遵循Beer定律，即在一定條件下，原子吸收與該物質(zhì)濃度成正比。共振線：電子從基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)

15、能級所吸收的譜線的為共振吸收線。簡稱為共振線。2. 組成 由光源、原子化器、分光系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)組成。（1）光源 有空心陰極燈、無極放電燈和蒸氣放電燈。（2）原子化器 將待測元素轉(zhuǎn)化為基態(tài)原子。（3）分光系統(tǒng) 將待測元素的特征譜線與其它譜線分開。由透光狹縫、色散元件和準(zhǔn)直鏡組成。（4）檢測系統(tǒng) 將光信號轉(zhuǎn)化為電信號并進(jìn)行放大處理，確定待測元素的含量。由檢測器和放大器組成。3. 應(yīng)用：在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要用于體液、毛發(fā)、指甲等組織鈣、鎂、鐵、鈉、鋅、鋁、汞、鉛、砷等多種元素的測定。優(yōu)點(diǎn)：（1）選擇性好，受干擾少，原子吸收是光的窄帶吸收，僅0.0010.01nm，而分子對光的吸收是寬帶吸收，達(dá)幾個(gè)nm。

16、（2）靈敏度較大火焰光度分析高12個(gè)數(shù)量級（3）測定快速、簡便（4）應(yīng)用范圍廣，可測多種元素，但需更換不同空心陰報(bào)燈，儀器昂貴。第二節(jié) 電化學(xué)分析電化學(xué)分析是一種以溶液電化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)測定物質(zhì)含量的分析方法。按測定量的電化學(xué)參數(shù)的不同，可分為電位法、電導(dǎo)法、庫侖法、極譜法和伏安法等，下面主要介紹電位法中的離子選擇電極法。離子選擇電極（ion selective electrode，ISE）是一種電化學(xué)敏感器，它的電勢與溶液中給定離子的活度的對數(shù)成線性關(guān)系，故可以通過簡單的電位測量，直接測定溶液中離子活度。離子濃度與離子活度的關(guān)系 a = f.c 在稀溶液中（104mol/L以下）活度系數(shù)接近1

17、。ISE分析法的優(yōu)點(diǎn)：1. 是一種直接的非破壞性分析方法，可反復(fù)進(jìn)行，不受樣品溶液顏色、渾濁等因素的干擾。2. 分析速度快，單次分析通常只12miv3. 測量范圍寬，45個(gè)數(shù)量級4. 操作簡便5. 測量的是離子活度，對臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)更有實(shí)用意義。一、ISE分析法的基本原理ISE大都屬于膜電極，膜中含有與待測離子相同的離子。膜的內(nèi)表面與具有相同離子的固定濃度溶液接觸，其中插入一內(nèi)參比電網(wǎng)極，膜的外表面與待測離子溶液接觸。由于電極膜材料、制備方法不同，使電極的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度也不同。膜電位的產(chǎn)生：當(dāng)電極置于待測離子溶液中時(shí)，由于離子的交換和擴(kuò)散作用，改變了兩相中原有的電荷分布，因而存在一

18、定的電位差，因?yàn)閮?nèi)充溶液中有關(guān)離子的濃度恒定，內(nèi)參比電極的電位固定，所以ISE的電位（E）只隨離子活度不同而改變，其電位可用Nernst方程式表示。ISE的E值不能直接測定，必須將ISE與參比電極浸入被測溶液中組成原電池，然后通過電動(dòng)勢來測定E值。參比電極：是指在溫度、壓力恒定的條件下，當(dāng)被測溶液離子濃度有所改變時(shí)，電極電位保持不變的電板。二、ISE的分類均相膜電極非均相膜電極晶體膜電極剛性基質(zhì)電極流動(dòng)載體電極基本電極非晶體膜電極離子選擇電極氣敏電極敏化電極酶電極（一）晶體膜電極 其敏感膜為金屬微溶鹽，經(jīng)加壓成片，制成單晶、多晶或混晶電極敏感膜，如氟電極，其敏感膜為LaF3單晶片。（二）非晶體

19、膜電極1. 剛性基質(zhì)電極 其敏感膜為薄玻璃，故稱為玻璃電極。成分一般為Na2O-AI2O3-SiO2改變這三種成分的配合比可分別制出對Li+、Na+、K+、Ag+的離子選擇電極。如：Na2OAI2O3SiO2 27% 4% 69% K+10.4% 22.6% 67% Na+2. 流動(dòng)載體電極 其敏感膜是由溶解在與水不相混溶的有機(jī)溶劑中的離子締合劑或絡(luò)合劑作為離子交換體，再將此溶液滲透在具有惰性，多孔性和疏水性的塑料薄膜內(nèi)。（三）氣敏電極 是基于界面化學(xué)反應(yīng)對氣體敏感的電極，它是在一般的離子選擇電極的基礎(chǔ)上，再覆蓋一層疏水的透氣膜（如聚四氟乙烯），如CO2、NH3電極。（四）酶電極 它由離子敏感

20、膜和覆蓋在表面含有酶的酶涂層所組成，敏感膜對待測物的酶促反應(yīng)有選擇性的響應(yīng)，如尿素酶電極。三、ISE的性能1. 響應(yīng)范圍及檢測下限 響應(yīng)范圍是指電極對待測離子的響應(yīng)符合Nernst公式的線性區(qū)，此范圍越寬越好，一般在47個(gè)數(shù)量級之間，檢測下限是指能夠檢測被檢離子的最低濃度，一般在105107mol/L。2. 選擇性 是指電極對待測離子和共存干擾離子的響應(yīng)程度的差異。常用選擇性系數(shù)或選擇比來描述，選擇性系數(shù)越小，表示電極選擇性越強(qiáng)。3. 響應(yīng)斜率和轉(zhuǎn)換系數(shù) ISE在Nernst響應(yīng)范圍內(nèi)被測離子活度變化10倍所引起的電極電位變化的數(shù)值，即響應(yīng)斜率（S），從理論上說，斜率為：但對某一ISE來說，實(shí)

21、際S值與理論S值并不完全相符，其偏差用轉(zhuǎn)換系數(shù)表示，一般轉(zhuǎn)換系數(shù)達(dá)到理論值90以上的電極性能較好。4. 電報(bào)壽命 取決于電極制作材料，結(jié)構(gòu)和使用保管情況。四、ISE分析定量方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其電位值Es，繪制Es-lgc標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下測定樣品溶液電位值Ex。2. 電極校正法 用標(biāo)準(zhǔn)溶液校正ISE，制成直讀式儀表。五、ISE分析方法的誤差1. 電動(dòng)勢測量，對于一價(jià)離子的響應(yīng)，電勢測量每差1mV引起濃度的相對誤差為4，對于二價(jià)離子則為8，因此對于測量電勢的儀表精度要求達(dá)到0.1mV。2. 溫度 Nernst公式中的斜率，內(nèi)參比電極的電位，以及離子活度等都

22、與溫度有關(guān)，因此在整個(gè)測量過程中應(yīng)保持溫度恒定。3. pH 溶液pH值可影響被測離子在溶液中的存在形式，從而影響相應(yīng)離子的活度，如LaF3電極測定F如pH5，F(xiàn)則會生成HF，使結(jié)果偏低。4. 滯后效應(yīng) 使用ISE若先測濃溶液后，再測稀溶液時(shí)電位平衡緩慢并出現(xiàn)誤差，這一現(xiàn)象稱為“滯后效應(yīng)”。第三節(jié) 電泳技術(shù)一、電泳的基本原理（一）電泳的概念溶液中帶電顆粒在直流電場中向電荷相反方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。利用電泳現(xiàn)象對物質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)叫電泳技術(shù)。電泳技術(shù)的應(yīng)用始于1937年，瑞典Tiselius利用界面電泳將血清蛋白質(zhì)分離成五種成分。1948年Wieland發(fā)明紙電泳，使電泳技術(shù)大為簡化。此后，電泳

23、技術(shù)發(fā)展迅速，特別是電泳技術(shù)與層析法，免疫學(xué)方法的結(jié)合，使其分辨率達(dá)到 mg/ml水平，成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的一種重要分析技術(shù)。（二）蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子中有電離帶正電荷的氨基，也有電離帶負(fù)電荷的羧基，故蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。在酸性條件下，羧基電離受抑制，NH2NH3帶正電。在堿性條件下，羧基電離受增強(qiáng)，COOHCOO帶負(fù)電。在某一pH溶液中，蛋白質(zhì)分子中氨基與羧基電離趨勢相等（或正負(fù)離子相等），靜電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。（三）電泳遷移率指帶電粒子在單位電場強(qiáng)度作用下的電泳速度，通常用表示 =V/EV為粒子移動(dòng)速度（cm/s）E為電場強(qiáng)度（V/cm）遷移率

24、取決于帶電粒子的性質(zhì)（粒子所帶電量Q，粒子大小、r、形狀）介質(zhì)粘度，對于球狀分子，根據(jù)Stoke定律V= QE/6rU=Q/6r在實(shí)際測定中，電泳速度V以單位時(shí)間t（秒）內(nèi)移動(dòng)的距離d（厘米）表示 V=d/t（cm/s）電場強(qiáng)度E以單位長度L（厘米）上所施加的電勢差V（伏特）表示E=V/L（V/cm）所以 通過測量d，L，V，t便可計(jì)算出顆粒的遷移率。由于不同的帶電粒子其遷移率的不同，因此在同一電場中的移動(dòng)距離不同，故能將其分離，根據(jù)公式dA=Vt/LA dB=Vt/LBA.B移動(dòng)距離差為d=（dAdB）=（AB）Vt/L分離距離與電壓和電泳時(shí)間成正比，與支持物長度成正比。二、電泳技術(shù)的分類和

25、電泳儀（一）電泳的分類1. 根據(jù)被分離樣品的多少 分析電泳，制備電泳。2. 根據(jù)電泳電壓的高低 常壓電泳，高壓電泳。3. 根據(jù)是否使用支持介質(zhì) 自由電泳，區(qū)帶電泳。4. 根據(jù)電泳系統(tǒng)的組成是否均一 連續(xù)電泳，不連續(xù)電泳。（二）電泳儀由直流電源和電泳槽兩部分組成。1. 直流電源 將交流電源經(jīng)整流，濾波后獲得。分為（1）恒壓電源 電泳過程中的電流恒定不變。但電泳過程中的熱效應(yīng)，降低外周電路的電阻，使電流慢慢增大。（2）恒流電泳 電泳過程中的電流恒定不變。用這種電流的輸出電壓可隨外周阻力減少而減少，從而保持電流恒定。（3）恒功率電源 電泳中輸出功率恒定不變。主要用于等電聚焦電泳。2. 電泳槽 盛裝緩

26、沖液和進(jìn)行電泳分析的場所，一般用塑料和有機(jī)玻璃制成，它包括電極，緩沖液槽，電泳支架，透明蓋組成。電泳槽的外形有水平式，垂直式，圓盤式等多種。電極應(yīng)具有良好的導(dǎo)電性，抗腐蝕性和抗電解作用。以鉑金材料最為理想，最好貫穿整個(gè)緩沖液槽。三、影響電泳的因素（一）電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度增大，電泳速度加快，但是同時(shí)電流增大，產(chǎn)熱增多，水分蒸發(fā)加速，甚至使蛋白質(zhì)變性。電場強(qiáng)度降低，電泳速度減慢，電泳時(shí)間延長。醋酸纖維薄膜電泳的電場強(qiáng)度一般為1015V/cm（二）電泳緩沖液 維持電泳介質(zhì)pH恒定，并起導(dǎo)電作用。1. 組成 由弱酸和弱酸鹽組成，常用的有磷酸鹽，硼酸鹽，巴比妥鹽和三羥甲基氨基甲烷（Tris）等，其中巴比

27、妥緩沖液用得最多，由巴比妥鈉和巴比妥組成。選擇緩沖液時(shí)應(yīng)考慮的因素。（1）化學(xué)性能穩(wěn)定，不易水解。（2）緩沖液的pH應(yīng)與弱酸的pK 值接近，有較強(qiáng)緩沖能力。（3）緩沖液中正負(fù)離子應(yīng)有相近的遷移率，避免電暈出現(xiàn)正負(fù)離子分布不均。（4）緩沖液的離子應(yīng)該是一價(jià)的，多價(jià)離子有較厚的雙電層，移動(dòng)性差。（5）緩沖液的電導(dǎo)率要低，避免通電時(shí)產(chǎn)生較多的熱。2. pH 緩沖液pH決定了蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，電泳時(shí)應(yīng)選擇一個(gè)合適pH，使各種蛋白質(zhì)在這一pH時(shí)凈電荷差別最大以利于分離。血清蛋白醋酸纖維薄膜電暈常用pH8.6的巴比妥緩沖液。各種蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。緩沖液pH的計(jì)算電泳過程水會發(fā)生電極。正極

28、：2OHH2O +1/2O2+2e pH負(fù)極：2H+ +2e H2 pH故電泳24次后應(yīng)將緩沖液正極交換，減少這種影響。3. 離子強(qiáng)度 是指溶液中各種離子的摩爾濃度（ci）與其電荷數(shù)平方（Zi2）乘積總和的1/2。即I=1/2cizi2 I的單位是mol/L。如0.1mol/L NaCL I=0.1mol/L 0.2mol/LMgCL2 I=0.6mol/L對于緩沖液I計(jì)算，由于弱酸的電離度很低，一般只計(jì)算鹽的。I愈大，緩沖能力越大，pH越穩(wěn)定，但緩沖液所載分電流增加，樣品所載的分電流減少，電泳速度減慢，導(dǎo)電能力增加，產(chǎn)熱增加。I過小，緩沖能力小，pH不穩(wěn)定，緩沖液所載分電流減少，樣品所載分電

29、流增加，緩沖液粘度系數(shù)降低，電泳速度加快。但樣品在支持物上擴(kuò)散嚴(yán)重，分辨率降低。兼顧兩方面的影響，一般在0.050.1mol/L。（三）支持介質(zhì) 對支持介質(zhì)的基本要求是具有化學(xué)惰性，不與被分離的樣品或緩沖液起化學(xué)反應(yīng)，并具有一定的堅(jiān)韌度。1. 吸附 使被分離樣品滯留，而降低電泳速度，造成拖尾而使分辨率降低。2. 電滲 電泳過程中液體對固體支持物的相對移動(dòng)稱為電滲。實(shí)際上是電泳材料表面的電荷引起水的定向移動(dòng)。當(dāng)電滲作用方向與電泳方向一致，電泳速度加快，順?biāo)兄?。?dāng)電滲作用方向與電泳方向相反，電泳速度減慢，逆水行舟。四、常用電泳技術(shù)區(qū)帶電泳是目前應(yīng)用最廣泛的一種電泳技術(shù)，區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)常用的有

30、濾紙，醋酸纖維薄膜，凝膠等。（一）濾紙電泳（PE）是應(yīng)用最早的支持介質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：材料價(jià)廉易得，有一定機(jī)械強(qiáng)度。缺點(diǎn)：電泳時(shí)間長，810小時(shí)，吸附作用大，造成拖尾而降低了分辨率，目前已淘汰。（二）醋酸纖維薄膜電泳（CAE）1957年Kohn首先采用，醋酸纖維素是將纖維素分子中葡萄糖單體上的羥基乙?；纬衫w維素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶劑溶解，涂成均勻薄膜。優(yōu)點(diǎn)：對蛋白質(zhì)吸附作用很小，分辨率高，區(qū)帶清晰，不吸附燃料，區(qū)帶周圍燃料可完全清掉，檢測靈敏度較高，樣品用量少0.32l，電泳時(shí)間短20min1h，可透明，便于用光密度掃描儀定量。缺點(diǎn)：有輕度電滲作用，吸水性較差，較脆。（三）瓊脂糖凝膠電泳

31、（AGE）瓊脂糖是從瓊脂中分離得到的一種多糖。主要由半乳糖和L-3，6-脫水半乳糖構(gòu)成。常用濃度0.51.0% 。優(yōu)點(diǎn)：吸附作用，電滲作用很小，故分辨率重現(xiàn)性好，應(yīng)用廣，同工酶，脂蛋白，免疫電泳，樣品用量少0.63.0l，電泳時(shí)間短30min1h。透明度好，電泳后可直接掃描定量，也可烘干制成薄膜。缺點(diǎn)：電泳完畢后區(qū)帶易擴(kuò)散，可及時(shí)固定。點(diǎn)樣方法，挖孔法，濾紙插入法。（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是一種人工合成的高分子材料，60年代新用于電泳分析，能將血清蛋白分為20多種組成。1. 優(yōu)點(diǎn)：（1）具有分子篩作用，分離效果好。（2）化學(xué)穩(wěn)定性高，是一種穩(wěn)定的親水膠體。（3）幾乎沒有吸附和電滲作

32、用。（4）機(jī)械強(qiáng)度好，無色透明，可直接光密度掃描。（5）可調(diào)節(jié)凝膠孔徑以適合不同分子量的分離。2. 聚合丙烯酰胺（Acr）+甲義丙烯酰胺（Bis）聚丙烯酰胺單體 交聯(lián)劑化學(xué)摧化 過硫酸銨-TEMED（四甲基乙二胺）系統(tǒng)引發(fā)劑 加速劑加速劑TEMED促使引發(fā)劑過硫酸銨形成自由基，自由基與Acr接觸，使Acr單體形成自由基而活化，引發(fā)聚合，聚合速度與pH、單體濃度、溫度有關(guān)。光催化 核黃素-TEMED系統(tǒng)，核黃素經(jīng)光照被還原成無色核黃素，在和痕量氧的條件下，無色核黃素又被氧化成核黃素自由基，使Acr活化，從而引發(fā)聚合。優(yōu)點(diǎn)：核黃素用量少（10mg/l），對樣品分析無影響，聚合時(shí)間可通過調(diào)節(jié)光照時(shí)間

33、，強(qiáng)度來控制。3. 孔徑與機(jī)械強(qiáng)度凝膠孔徑由凝膠總濃度和交聯(lián)度決定。凝膠總濃度T（g/dl）表示100ml凝膠中Acr和Bis的總克數(shù)，T值越大，孔徑越小。交聯(lián)度C（%）表示交聯(lián)劑Bis占凝膠總濃度T的百分比，C值越大，孔徑越小。T值固定不變時(shí)，C值在5%時(shí)，凝膠孔徑最小，大于或小于5%，孔徑都會增大。常用標(biāo)準(zhǔn)膠T=7.5g/dl，孔徑約5nm。凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度全要取決于T及Acr與Bis的比值。通常要求 T為2%5% Acr/ Bis=20 5%10% Acr/ Bis=40 15%20% Acr/ Bis=1252004. 分類 圓柱型根據(jù)凝膠的形狀： 水平式 平板型 垂直式連

34、續(xù)（均相），操作方便。根據(jù)凝膠系統(tǒng)和緩沖液組成 不連續(xù)（多相），分離效果好。5. 分離原理聚丙烯胺凝膠電泳大多屬于不連續(xù)電泳。（1）兩種不同孔徑的凝膠系統(tǒng)；（2）電泳過程中形成不均勻不連續(xù)系統(tǒng) 上層大孔徑濃縮膠T23g/dl、Tris-HCL、pH6.7。下層小孔徑分離膠，T510g/dl，Tris-HCL，pH8.9。電極緩沖液Tris-甘氨酸pH8.3。（3）電極槽，兩層凝膠中的緩沖液pH和組成不同。高分辨率主要是由于下面三種效應(yīng)1. 樣品濃縮效應(yīng) Cl遷移率最大 快離子，解離度最小的甘氨酸離子遷移率最小 慢離子。蛋白質(zhì)離子介于兩之間，快離子與慢離子之間形成低導(dǎo)電區(qū)，有較高的電位梯度，促進(jìn)

35、蛋白質(zhì)和慢離子的移動(dòng)，使蛋白質(zhì)樣品被壓縮為一薄層。2. 分子篩效應(yīng) 蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠，由于凝膠有一定的孔徑，不同的蛋白質(zhì)分子大小不同，受到的阻力不同，小分子受阻力小，走在前面，大分子受阻力大，走在后面。3. 電荷效應(yīng) 同一般電荷。五、蛋白質(zhì)區(qū)帶的定性和定量分析（一）蛋白質(zhì)區(qū)帶的染色 蛋白質(zhì)電泳分離后可以直接用紫外光密度掃描儀定量（利用蛋白質(zhì)對280nm紫外光的吸收），但需專門的儀器，故臨床上一般采用染色來進(jìn)行定性或定量分析。蛋白質(zhì)染色劑大多是陰離子燃料，易與蛋白質(zhì)陽離子結(jié)合，因此在pHpI的酸性溶液中較強(qiáng)。常用的染色劑有氨基黑10B，溴酚藍(lán)，麗春紅S。（二）蛋白質(zhì)區(qū)帶的定性分析 經(jīng)染色后，首先

36、應(yīng)仔細(xì)觀察有無異常區(qū)帶。如多發(fā)性骨髓瘤病人有大量單克隆蛋白質(zhì)（主要是IgG或IgA）電泳時(shí)可在和之間呈現(xiàn)一條區(qū)帶，稱為M區(qū)帶。（三）蛋白質(zhì)區(qū)帶的定量分析 蛋白質(zhì)電泳的定量分析通常以各區(qū)帶占總量的百分率表示 如同時(shí)測定了蛋白質(zhì)總量，也可換算成各組分的絕對量（g/L）表示。如血清蛋白質(zhì)電泳經(jīng)氨基黑10B染色A：66% 1：3% 2 ：7% ：10% ：15% 總蛋白75 g/L 49.5 g/L 2.25 g/L 5.25 g/L 7.25 g/L 11.25 g/L1. 光密度儀直接掃描法 透明的電泳圖譜可用光密度儀直接掃描得出各組分的百分率。操作簡便，迅速，誤差小，結(jié)果較準(zhǔn)確。2. 洗脫比色法

37、 染色后將各區(qū)帶分別剪下侵入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，將蛋白質(zhì)吸附的染料全部洗脫，然后進(jìn)行比色，求出各組分的百分含量。操作繁瑣，費(fèi)時(shí)，準(zhǔn)確度不如光密度儀直接掃描法。六、電泳新技術(shù)簡介（一）等電聚焦電泳（IEFE）是利用具有線性pH梯度的兩性電解質(zhì)為載體，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)等兩性分子的一種電泳新技術(shù)。其分辨率可達(dá)0.01 pH單位，特別適用于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)分子。正常人血清蛋白質(zhì)采用此法可分出50多條區(qū)帶。1. 基本原理 在電泳系統(tǒng)中建立一個(gè)從正極到負(fù)極，pH由低到高的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度。處于這一系統(tǒng)的各種蛋白質(zhì)，根據(jù)各自pI與所處環(huán)境pH值的差別帶上正電或負(fù)電，電泳時(shí)逐漸靠近與其p

38、I相同的pH位點(diǎn)，而不斷失去凈電荷，直至達(dá)到pH= pI，凈電荷為零時(shí)，不再受電場力的作用，而達(dá)到聚焦。基本條件：（1）建立一個(gè)穩(wěn)定、重復(fù)性良好的連續(xù)pH梯度。 （2）有一個(gè)抗對流的材料，防止已分離樣品重新混合。 （3）電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉龛b定分離的區(qū)帶。2.pH梯度的建立 能建立穩(wěn)定pH梯度的兩性電解質(zhì)是一種多羧基、多氨基的脂肪族化合物。如瑞典LKB公司生產(chǎn)的商品名為“Ampholine”的，它由丙烯酸和多乙烯多胺合成。理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：（1）各成分的導(dǎo)電能力彼此相近。（2）各成分的pI彼此接近，并在pI附近有良好的緩沖能力。（3）分子量小，易于與樣品分離。（4）對280

39、nm紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品測定。（二）雙向電泳是先把樣品從一個(gè)方向進(jìn)行電泳分離，然后在與其成90。 方向上進(jìn)行第二次電泳分離。如第一次電泳可以其電荷性質(zhì)為基礎(chǔ)；第二次電泳則以分離量不同進(jìn)行分離。通常將等電聚焦電泳為第一相電泳，以SDS-聚丙烯酰胺凝膠為第二相電泳。（三）轉(zhuǎn)移電泳又稱印跡轉(zhuǎn)移電泳。此項(xiàng)技術(shù)是1975年由E，M，Southern在進(jìn)行DNA片段的研究中首先使用。將凝膠電泳所得區(qū)帶經(jīng)吸附作用轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜（NC膜）上，由于轉(zhuǎn)移過程類似于將墨跡吸到吸水紙上，故稱為(Southern bolt 印跡法)。1977年Alwine 將此法應(yīng)用于RNA研究，取名 Nert

40、hern blot。1979年Towbin 又將其擴(kuò)展到蛋白質(zhì)研究，將其風(fēng)趣的稱為 Western blot.1981年，Reinhart等將等電聚焦電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC上，取名為 Eastern blot.轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)包括三個(gè)步驟1. 采用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)或核酸，電泳方式有單向，雙相，梯度，等電聚焦等。2. 轉(zhuǎn)移電泳，將已分離的蛋白質(zhì)或核酸經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到NC或重氮芐氨基甲基紙上，前者為非共價(jià)吸附，后者為共價(jià)結(jié)合。3. 鑒定膜上的蛋白質(zhì)或核酸 ，方法有，放射自顯影，酶標(biāo)免疫化學(xué)等。轉(zhuǎn)移電泳的優(yōu)點(diǎn)，對分離蛋白質(zhì)的鑒定，比在凝膠上的操作要簡便，轉(zhuǎn)移電泳實(shí)際上是將凝膠電泳的高分辨率與放射標(biāo)記或酶

41、標(biāo)等免疫化學(xué)法的高靈敏度結(jié)合起來。第四節(jié) 層析技術(shù)層析法又稱色譜法、色層分離法，1906年由俄國植物學(xué)Tswett首先用于植物色素的分離提取而得名。目前，層析技術(shù)發(fā)展迅速已成為生物化學(xué)、分子生物等及生物工程等學(xué)科常用的分離分析方法，如氣體、無機(jī)離子、AA、糖類、脂類、Vit、藥物，以及大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的分析。一、層析的概念與分類（一）基本概念層析法是利用待分離物質(zhì)中不同組分的某些與理化性質(zhì)（在兩相中溶解、吸附、親和作用等）的差異而建立起來的一種分離技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)均由因定相和流動(dòng)相組成，固定相是固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)的液體，流動(dòng)相是可以流動(dòng)的物質(zhì)，如水、某些溶劑和氣體。當(dāng)待分

42、離的混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異，它們在固定相和流動(dòng)相中的分配比不同，隨溶媒的向前移動(dòng)，各組分不斷地在兩相中進(jìn)行再分配，與固定相作用力越弱的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，向前移動(dòng)速度快，反之，與固定相作用強(qiáng)的組分，則向前移動(dòng)速度慢，由于產(chǎn)生了差速遷移而達(dá)到分離目的，如紙層析、薄層層析、薄膜層析、層析移動(dòng)的速度用比移值或阻滯因子（Rf）來表示。（二）層析法分類液固層析法（LSC）液液層析法（LLC）1. 按兩相所處的狀態(tài)不同分類 按流動(dòng)相的狀態(tài)不同，再按固定相的狀態(tài)不同。 液相層析法（LC）氣固層析法（GSC）氣液層析法（GLC）層析法 氣相層析法（GC

43、）2. 按層析分離機(jī)制（分離原理）分類1）吸附層析法（AC） 固定相是固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力的差別而分離。2）分配層析法（PC） 固定相是液體，利用各組分在流動(dòng)相和靜止液相（固定相）中的分配系數(shù)不同的分離。3）離子交換層析法（IEC） 固定相是離子交換劑，利用各組分對離子交換劑親和力的不同而分離。4）凝膠層析法（GPC） 固定相為多孔性凝膠，利用各組分分子大小、形狀不同在凝膠中受阻滯的程度不同而分離。5）親和層析法（affinity chromatogrphy） 利用各組分生物學(xué)特殊性不同而建立的一種層析方法，固定相只能和一種待分離成分專一結(jié)合，使其與其他物質(zhì)分離，如利用抗

44、原、抗體的結(jié)合來分離相應(yīng)的抗原或抗體。3. 按操作形式不同分類1）柱層析法（column chromatogrphy，CC）固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)向到分離。2）薄層層析法（thin leyez chromatogrphy，TLC） 將顆粒狀的固定均勻地鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開。3）紙層析法（paper chromatogrphy，PC）用濾紙作為液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開。4）薄膜層析法（thin film chromatogrphy，TFC）用高分子有機(jī)吸附劑制成薄膜，以類似紙層析的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離。（三）層析中的常用術(shù)語1. 保留值（retention value

45、）表示標(biāo)本中各組分在層析柱中停留的時(shí)間的長短或組分流出時(shí)所需流動(dòng)相體積的多少，用來描述層析峰在層析圖上的位置。2. 層析峰區(qū)域?qū)挾?常用的表示法有三種（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差：當(dāng)峰呈對稱的正態(tài)分布時(shí)，是峰高0.607處峰寬度的1/2。（2）半峰高寬度（W1/2）：層析峰高一半處的峰寬度，W1/2=2.354。（3）層析峰底寬（W）：是指通過層析峰兩拐點(diǎn)作切線交于基線上的截距。W=4。3. 分離度（resolution） 是定量描述相鄰兩組分在層析柱內(nèi)分離情況的指標(biāo)，可峰底分離度、峰半高寬分離度和峰高分離度等不同方式表示，峰底分離度等于相鄰兩組分層析峰保留值之差與層析峰平均底寬之比。是國內(nèi)外廣泛采用的一個(gè)

46、分離度指標(biāo)，用R表示。4. 比移值（Rf） 是溶質(zhì)譜帶中心移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)的距離之比。5. 分配系數(shù) 在層析分離中，物質(zhì)既進(jìn)入固定相，又進(jìn)入流動(dòng)相，此過程稱分配過程。物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相達(dá)到平衡時(shí)，它在兩相中平均容度的比值稱分配系數(shù)。二、層技術(shù)在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用（一）薄層層析在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用薄層層析根據(jù)固定相的不同有吸附、分配和離子交換等技術(shù)，以吸附薄層層析為例說明其基本方法。1. 固定相與流動(dòng)相及選擇（1）固定相 為吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素等，固定相選擇應(yīng)考慮的因素。酸堿性 如硅膠是弱酸性吸附劑，適合于酸性和中性物質(zhì)的分離，氧化鋁是微堿性吸附劑，適合于堿性和中性物

47、質(zhì)分離，硅藻土、纖維素屬中性吸附劑。吸附能力 常稱為活度，主要受含水量的影響，含水量高活度低，從強(qiáng)到弱分為、5級，活度強(qiáng)吸附作用強(qiáng)，一般分離水溶性物質(zhì)活度弱些，而分離脂溶性物質(zhì)活度要強(qiáng)些。顆粒狀大小 為了使每次測定的Rf值恒定，吸附劑要求顆粒大小均勻、適當(dāng)，顆粒細(xì)、吸附能力強(qiáng)，展開慢、顆粒粗、吸附能力弱，展開快、分離效果差，一般顆粒直徑為，無機(jī)類0.070.1mm（150200目），有機(jī)類0.10.2（70140目）。（2）流動(dòng)相 即展開劑，展開劑的選擇是薄層層析中又一關(guān)鍵，一般極性大的化合物需用極性大的展開劑。2. 薄層層析法操作技術(shù)（1）制板 常用方法有三種。干法、濕法和燒結(jié)法。干法制板（

48、軟板），常用厚度0.253.0mm，方法簡便，但不堅(jiān)固易吹散，只能水平放置，點(diǎn)樣，顯色需加小心；濕法制板（硬板），加入一定粘合劑（石膏、羧甲基纖維素鈉、淀粉等）；燒結(jié)法制板，吸附劑加入一定量無水乙醇調(diào)成糊狀制板，然后放入高溫爐中加熱至750、6075min，機(jī)械強(qiáng)度好，可反復(fù)使用。制成的板要求涂布均勻、光潔，晾干、活化。（2）點(diǎn)樣 用毛細(xì)玻管點(diǎn)樣，斑點(diǎn)直徑約2mm，板據(jù)需要可點(diǎn)23次，點(diǎn)樣處距下端1.5cm。（3）展開 將層析板放入加有展開劑的層折槽中，立即蓋嚴(yán)，展開距離10cm取出，劃出溶劑前沿線。（4）顯色，等溶劑揮發(fā)后，用相應(yīng)顯色劑顯色。3. 薄層層折法的定性及定量 定性分析主要依據(jù)Rf

49、值，與標(biāo)準(zhǔn)液的Rf比較。定量采用專用的薄層掃描儀，測量斑點(diǎn)的深淺、大小，并與標(biāo)準(zhǔn)液斑點(diǎn)比較。4. 應(yīng)用 主要用于AA、肽、核昔酸、糖類、脂類和激素生物質(zhì)的分離和鑒定。（二）凝膠層折在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用又稱凝膠過濾、分子篩層折、排阻層折。固定相是多孔凝膠，商品凝膠是干燥顆粒，當(dāng)吸附一定量液體后溶脹成一種柔軟而富有彈性的物質(zhì)，由于凝膠有一定孔徑，對分子大小不同的組分的阻滯作用不同。在被分離物質(zhì)中，大分子組分由于直徑大，不易進(jìn)入凝膠孔徑內(nèi)，隨流動(dòng)相向前移快，小分子組分則能進(jìn)入凝膠微孔內(nèi)，向前移動(dòng)慢，而達(dá)到分離。1. 凝膠的種類和性能 常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠。（1）葡聚糖凝膠

50、 將右旋葡萄糖的線性聚合長鏈間，用交聯(lián)劑1-氯代-2、3-環(huán)氧丙烷通過醚橋交聯(lián)而成。穩(wěn)定性好，不溶于水，但在酸性條件下糖苷鍵易水解，由于分子中含有大量羥基，因此有很大的親水性，吸水后溶脹成透明，而且有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的彈性顆粒，孔隙的大小與交聯(lián)度有關(guān)，交聯(lián)度大，孔隙小、吸水量小，商品膠型號多以吸水量10倍表示，如每克干膠吸水量為2.5g，即為G-25型，國外最著名的交聯(lián)葡聚糖商品名為Sephadex。（2）聚丙烯酰胺凝膠 層析用的聚丙烯酰胺凝膠商品名為生物凝膠-P（Bio-gel-P），是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis），經(jīng)自由基引發(fā)聚合而成，型號有P-2，P-4，P-6，P-1

51、0，P-30，P-60，P-100，P-150，P-200，P-300，可分離子肽及蛋白質(zhì)量，10040萬。具有隋性，但在酸堿性較強(qiáng)的情況下不如葡聚糖凝膠穩(wěn)定，適用pH范圍2-11，使用范圍與效果和葡聚糖凝相似。（3）瓊脂糖凝膠 屬于天然凝膠，從瓊脂中提取結(jié)構(gòu)為D-半乳糖和L-3.6-脫水半乳糖的殘基交替所組成的多聚糖，常用商品名是Sepharose和Bio-gel-A，型號有Sepharose2B、4B、6B，數(shù)字表示瓊脂糖含量（W/W）。機(jī)械強(qiáng)度大，分子量使用范圍寬（達(dá)108），吸附生物高分子能力最低，常用于高分子物質(zhì)的分離，但穩(wěn)定性很差，使用條件限制較嚴(yán) （T 040、pH49）。2.

52、凝膠層析中應(yīng)注意的幾個(gè)問題。（1）柱直徑與長度 凝膠層析一般為柱層析，柱直徑一般在15cm，長度L與直徑D比值L/D一般為710，但對移動(dòng)緩慢的物質(zhì)宜3040。（2）凝膠的選擇 一般要以大分子物除去小分子物質(zhì)時(shí)，如從蛋白質(zhì)溶液中去除鹽和AA，可選用交聯(lián)度大的，如葡聚糖G-25或G-50，反之欲將小分子物質(zhì)收集濃縮而去除大分子，則應(yīng)選用交聯(lián)度小的，如G-100或G-150。（3）樣品的濃度和體積 大分子物質(zhì)溶液粘度隨濃度增大而增大，而影響分離效果，一般將粘度控制在5cp（厘泊）以下，樣品體積小于凝膠總體積的5%10%。3. 凝膠層析的應(yīng)用（1）去鹽 高分子（如蛋白質(zhì)核膠、多糖等）溶液中的低分子雜

53、質(zhì)，可用凝膠層折法除去，這一過程稱為去鹽。（2）高分子溶液的濃縮 如蛋白質(zhì)的稀溶液需要濃縮時(shí)，可加入葡聚糖G-25或G-50的干膠，蛋白質(zhì)稀溶液中的水份及小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部孔隙中，蛋白質(zhì)則在顆粒外，將溶脹后的凝膠分離除去，得到濃縮的蛋白質(zhì)濃液。（3）用于分離提純 廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、AA、核苷酸、多糖、激素、抗生素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。（4）用于測定高分子物質(zhì)的分子量 用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，放入同一凝膠柱，在同一條件下層折，測定每種組分的保留體積，并以保留體積對分子量的對數(shù)作圖，得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。（三）高效液相層析在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用高效液相層析（high performa

54、mce liquid chromatogaphy，HPLC），又稱為高效液相色譜法，始于60年代末，是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上引進(jìn)氣相層析理論發(fā)展起來的，它具有氣相層析的全部優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了氣相層析的缺點(diǎn)，具有分離能力強(qiáng)，測定靈敏度高（ng水平），應(yīng)用范圍廣（極性到非極性、小分子到大分子、熱穩(wěn)定與不穩(wěn)定化合物），在室溫下進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)。HPLC裝置儀器化，它包括輸液系統(tǒng)、層析柱和檢測系統(tǒng)三部分，輸液系統(tǒng)主要是一高壓泵將流動(dòng)相輸入，層析柱按分離機(jī)理不同分為：吸附、分配、離子交換等類型，檢測器應(yīng)用最多的是紫外吸收檢測器、熒光檢測器、信號送入數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或記錄儀。在臨床生化檢驗(yàn)中HPLC已用于類固醇激素、兒茶酚胺的測定，同工酶的分離，治療藥物的監(jiān)測和篩選。第六節(jié) 自動(dòng)生化分析技術(shù)臨床生化自動(dòng)分析儀，就是把生化分析中的取樣、加試劑、去干擾、混合、保溫反應(yīng)、檢測、結(jié)果計(jì)算、顯示和打印，以及清洗等步驟自動(dòng)化的儀器。它完全模仿并代替了手工操作。不僅提高了工作效率，而且減少了主觀誤差，穩(wěn)定了檢驗(yàn)質(zhì)量。由于這類儀器一般都具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、節(jié)省和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使得生化自動(dòng)分析儀在臨床生化分析中得到了廣泛應(yīng)用。一、自動(dòng)生化分析儀的類型（一）管道式分析儀管道式分析儀的特點(diǎn)是測定項(xiàng)目相同的各待測樣品與試劑混合后的化學(xué)反應(yīng)，是在同一管道中經(jīng)流動(dòng)過程完成的。這類儀器一般可