（精選）用Quantity-One進(jìn)行定量分析的方法

1、用Quantity One進(jìn)行定量分析的方法 生物技術(shù) 2009-09-06, 21:17 葉林 Quantity One是Bio-Rad公司的凝膠電泳圖像獲取、處理以及定量分析軟件。功能很強(qiáng)大，到底多么強(qiáng)大在這就不說(shuō)了。用處很多，到底多么多在這也不說(shuō)了，具體功能請(qǐng)參考Quantity One使用說(shuō)明及相關(guān)教程。下面只是Quantity One用于DGGE結(jié)果定量分析的一般操作方法：有下面這么一張DGGE圖像，需要分析一下左邊第5條泳道的8個(gè)條帶對(duì)應(yīng)的DNA在樣品中占的百分比各分別是多少。第一步：建立泳道點(diǎn)擊菜單欄“Lane-Auto Frame Lanes”，一般情況下Quantity On

2、e會(huì)自動(dòng)識(shí)別并建立泳道。但也有很多時(shí)候不能自動(dòng)建立泳道，這就需要選擇菜單欄“Lane- Frame Lanes”然后輸入要建立泳道的數(shù)目，手動(dòng)建立泳道。泳道建立后需要調(diào)整，在菜單欄“Lane-Edit Frame”中有拉伸、旋轉(zhuǎn)、移動(dòng)、添加/刪除錨點(diǎn)等選項(xiàng)，通過(guò)這些選項(xiàng)可以對(duì)泳道進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后大致如下：第二步：消除泳道背景點(diǎn)擊菜單欄“Lane-Lane Background”跳出一個(gè)對(duì)話框，“All Lanes”中選擇第二個(gè)，然后點(diǎn)一下第5條泳道，“Selected Lane”的下面會(huì)顯示Selected Lan:#5(#5)，然后選擇”Lane On“ Rolling Disk Size中

3、填一個(gè)1020之間的數(shù)(可以多嘗試幾個(gè)，看看效果)，最后點(diǎn)“Done”完成操作。第三步：建立條帶點(diǎn)擊菜單欄“Band->Detect Bands”打開(kāi)一個(gè)對(duì)話框，調(diào)整Sensitivity和Lane Width的數(shù)值，使每個(gè)條帶都被檢測(cè)到，如果條帶上面顯示的是一條紅線，可以在“Band-Band Attributes”的Style欄中選擇Brackets，使之顯示為括號(hào)形式。條帶建立后圖像顯示如下：第四步：生成報(bào)告點(diǎn)擊菜單欄“Report-Lane Report”然后點(diǎn)一下第五條泳道，在彈出的對(duì)話框的Measurements 一欄中選擇Trace Qty (個(gè)人感覺(jué)選擇這個(gè)比較合適，也可

4、以選擇其他的看看效果)，然后點(diǎn)Report，就看到了每個(gè)條帶的Trace Qty值，這個(gè)值與DNA的濃度呈正比，根據(jù)這個(gè)值計(jì)算百分比即可。以上僅僅是Quantity One進(jìn)行定量的簡(jiǎn)單流程，非常不具體，一些具體的參數(shù)設(shè)置及軟件的其它功能請(qǐng)參考相關(guān)的使用說(shuō)明或教程。另外，不確定上面的操作是否有不當(dāng)之處，如有請(qǐng)多指教。需要特別說(shuō)明的一點(diǎn)是：對(duì)于一個(gè)從復(fù)雜的環(huán)境樣品中提取的DNA，經(jīng)過(guò)PCR-DGGE，然后用Quantity One定量，通過(guò)分析每條條帶的intensity來(lái)計(jì)算百分比，然后估計(jì)原始樣品中各個(gè)物種（比如細(xì)菌）的百分比，這樣的做法是非常不準(zhǔn)確的，這種數(shù)據(jù)發(fā)paper可能不會(huì)被接受，因

5、為整個(gè)過(guò)程中存在很多Bias。同理，T-RFLP也存在類(lèi)似問(wèn)題。 Quantity One施用教程大全（轉(zhuǎn)貼）2010-11-11 09:531 - 內(nèi)容簡(jiǎn)介 凝膠電泳是每個(gè)做份子有生命的物質(zhì)學(xué)的同窗天天都要打交道的基本技術(shù)。電泳然后的信息處理與電泳本身同樣重要。今朝有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，比較有名的比如BandScan、BandLeader、Sigma Gel等等。今日要向大家介紹的是來(lái)自Bio-Rad的1D凝膠定量軟件Quantity One（Bio-Rad還有一個(gè)做2D凝膠分析的軟件PDQuest）。這個(gè)軟件的最新版本可以在Bio-Rad的主頁(yè)不收費(fèi)下載。今朝的最新版本

6、是4.52版 2 - Quantity One的定量方法 Quantity One的分析功能顧名思義首要用來(lái)舉行凝膠或培養(yǎng)皿的熒光定量分析。它的分析功能或說(shuō)分析方式首要有4種：泳道/條帶軌跡定量法；等高線直接定量法；菌落計(jì)數(shù)；份子量測(cè)定 - - - 這三種方法中施用最為利便也是最為廣泛的應(yīng)該是等高線定量法（Volumn Contour）。它經(jīng)由過(guò)程半AUTO描繪電泳條帶的等高線邊沿來(lái)得到等高線區(qū)域內(nèi)部平面或物體表面的大，再將該平面或物體表面的大乘以區(qū)域內(nèi)平均光疏密程度值當(dāng)?shù)綏l帶內(nèi)部總的信號(hào)量。固然這種分析方法的蠹弊顯而易見(jiàn)：無(wú)法同等得排除不同泳道的配景亮度；等高線的繪制處于“半AUTO”狀態(tài)，

7、即需要人為判斷作為等高線標(biāo)準(zhǔn)的電泳條帶的邊沿；最致命的是在幾個(gè)電泳條帶距離十分接近的時(shí)辰幾乎無(wú)法繪制純一條帶的輪廓（常出現(xiàn)持續(xù)的幾個(gè)條帶等高線相連而無(wú)法分離出獨(dú)自條帶的輪廓）。 三種方法中個(gè)人感覺(jué)最為科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽?yīng)該是泳道/條帶軌跡定量法（Trace Tracking）。這種方法施用起來(lái)步調(diào)較為繁瑣，必需經(jīng)由過(guò)程泳道識(shí)別-電泳條帶識(shí)別兩個(gè)持續(xù)的步調(diào)才氣舉行定量。然而這種方式的最大長(zhǎng)處在于它可以純粹丟棄人為主觀因素舉行全AUTO定量。他的定量方式為：首先根據(jù)不同電泳條帶的光疏密程度值繪制光疏密程度曲線，然后計(jì)算光疏密程度曲線下平面或物體表面的大作為電泳條帶的定量根據(jù)。大家可能會(huì)問(wèn)他能不能排除泳道

8、配景？謎底是必定的，它能夠最大程度的排除不同泳道之間的配景差異，讓各個(gè)泳道上的不同電泳條帶在一條幾乎不異的開(kāi)始跑線上舉行相比較。這個(gè)配景排除功能是等高線法無(wú)法做到的（等高線法也有基本的配景排除措施，但是和泳道/條帶軌跡定量法的配景排除不是一個(gè)等級(jí)的。等高線法只能排除同一泳道上的配景，而不能均等的排除不同泳道的配景）。另外泳道/條帶軌跡定量法還可以聯(lián)合Gauss Model Bands對(duì)緊密相連的電泳條帶舉行分析，而這種條帶也是等高線法無(wú)法分析的。我們這次重點(diǎn)學(xué)習(xí)這個(gè)方法。 第三個(gè)分析功能是菌落計(jì)數(shù)（Colony Counting）。這個(gè)功能其實(shí)很實(shí)用，可以分析藍(lán)白篩選的結(jié)果。但是很奇怪My c

9、omputer居然無(wú)法運(yùn)行這個(gè)功能， 因此無(wú)法向大家介紹了。 另外Quantity One還可以經(jīng)由過(guò)程回歸曲線測(cè)定份子量。 下面讓我們了解一下Quantity One經(jīng)常使用的基本菜譜操作。 - - - 打開(kāi)文件：由于Quantity One是Bio-Rad的硬件組成一套軟件，因此Quantity One可以AUTO輸入來(lái)自Bio-Rad公司的凝膠分析儀的數(shù)據(jù)。具體支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers”里面設(shè)置。如果您的實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有接納Bio-Rad的硬件設(shè)施也沒(méi)瓜葛。您只要將電泳圖片用ACDSee等程序轉(zhuǎn)換為T(mén)IF圖片格式就能夠被Quantity One識(shí)別

10、了。注重Quantity One只支持8位和16位灰度的TIF文件。 Quantity One彷佛有一個(gè)小bug，就是在按“Open”然后并沒(méi)有立刻彈出資源管理器讓你選擇方針文件的位置。其實(shí)你只要將鼠標(biāo)在熒幕右下方點(diǎn)擊一下，資源管理器就會(huì)乖乖彈出來(lái)了. Quantity One只能分析白的顏色配景 玄色條帶的電泳圖。而我們正常環(huán)境下得到的一般都是玄色配景 白的顏色條帶的電泳圖。我們可以在“Image-Invert data中將圖片顏色舉行反轉(zhuǎn)，然后即可以用Quantity One舉行分析了. 文字注解：Quantity One提供基本的文字注解功能。您可以在您的電泳圖片上記載您的分析結(jié)果比如電

11、泳條帶的份子量、光疏密程度值、事物的量等等。這個(gè)功能可以經(jīng)由過(guò)程“Edit-Text Overlay Tools”來(lái)使成為事實(shí)。在彈出的浮動(dòng)工具欄入選擇“ABC”或“”就能夠舉行文字輸入和畫(huà)標(biāo)志線的操作。 光疏密程度工具：在“View-Plot Density”的下級(jí)菜譜中大家會(huì)見(jiàn)到幾個(gè)和電泳條帶光疏密程度值相干的預(yù)示選項(xiàng)。大家可以別離選擇不同的選項(xiàng)感受一下它們之間的不同。選擇方法是點(diǎn)擊響應(yīng)的下級(jí)菜譜比如“Plot Cross Section”，然后將變成帶一個(gè)藍(lán)色感慨號(hào)的鼠標(biāo)移到您想懂得光疏密程度的位置，點(diǎn)擊一下就會(huì)預(yù)示該處的光疏密程度相干信息。鄙人面這幅圖片中我們可以看見(jiàn)兩條黃線交叉處的電

12、泳條帶的相干信息。上方的一串曲線是不同泳道之間在同一平行線上的光疏密程度比率曲線；左邊是黃線交叉處地點(diǎn)泳道的幾個(gè)電泳條帶的光疏密程度漫衍環(huán)境。 3D Viewer：在“View-3D Viewer”菜譜中大家會(huì)看到一個(gè)有趣的功能叫做3D Viewer。這個(gè)玩意按照Bio-Rad的說(shuō)法可以輔助鑒別幾條緊密相連在一路的電泳條帶的漫衍環(huán)境。大家只要選擇了這個(gè)號(hào)令后鼠標(biāo)就會(huì)一個(gè)“ ”型，然后將 型移動(dòng)到您感興趣的位置，拖動(dòng)鼠標(biāo)畫(huà)出一個(gè)正方形區(qū)域，然后用鼠標(biāo)雙擊，Quantity One就會(huì)將這塊區(qū)域按照gauss漫衍規(guī)律渲染成一個(gè)三維模子，頗有意思。但個(gè)人感覺(jué)這個(gè)功能噱頭多于實(shí)用。 4 - Quant

13、ity One的基本配景排除功能 最起頭的時(shí)辰我們就說(shuō)過(guò)Quantity One的等高線定量模式也有一種比較基本的配景排除方法。這個(gè)方法同樣也合用于泳道/條帶定量模式。此刻我們就來(lái)學(xué)習(xí)這個(gè)方法?；九渚芭懦墓δ芪挥凇癐mage-Substract backgroud.”和“Image-Filter Wizard.”這兩個(gè)菜譜。 - - Image-Filter Wizard：這個(gè)功能是對(duì)原始圖片做一些開(kāi)真?zhèn)€加工，主如果祛除一些圖片上的“斑點(diǎn)”。這些斑點(diǎn)首要有兩種類(lèi)型：一種是深色的“胡椒面”型和淡色的“食鹽”型，兩種斑點(diǎn)都可以毫不猶豫地去除。從“Image-Filter Wizard.”菜譜調(diào)

14、出向?qū)Р俗V后選擇“pepper”和“salt”，下面兩個(gè)選項(xiàng)可以按照程序默許的選項(xiàng)，然后“OK”就能夠完成這第一步的降噪歷程。 Image-Substract backgroud：這個(gè)功能是真正對(duì)圖片配景舉行清理的工具（區(qū)別于“Image-Filter Wizard.”的降噪模式）。只是這種清理是一種“全局”型的清理，即它以不異的參量對(duì)每條泳道舉行配景清理。然而在清理方式上它照舊可以分成兩種不同的方式： Backgroud Box：一種是以一個(gè)局部小平面或物體表面的大為標(biāo)準(zhǔn)配景，將整張電泳圖片上所有比該區(qū)域光疏密程度值低的區(qū)域全部漂白。這種發(fā)型稱(chēng)為“Backgroud Box”。操作時(shí)用鼠標(biāo)選

15、中對(duì)話框下部左側(cè)的“Backgroud Box”按鍵，然后用鼠標(biāo)在電泳圖片上選擇一塊顏色近乎配景色，色澤比較勻稱(chēng)的區(qū)域，用鼠標(biāo)拖動(dòng)畫(huà)出一個(gè)正方形。開(kāi)釋鼠標(biāo)后程序就會(huì)當(dāng)即對(duì)電泳圖片舉行降低配景的處理； Backgroud Stripe：相對(duì)于“Backgroud Box”來(lái)講是一種更加智能化的處理方式。它出格合用于梯度凝膠，即凝膠濃度由上至下依次變化。由于梯度膠的光疏密程度值在一定距離內(nèi)不斷變化，因此如果接納“Backgroud Box”的方法除配景就會(huì)發(fā)生偏差。Quantity One此時(shí)提供一種隨著凝膠濃度變化而變化的除配景方式就是“Backgroud Stripe”。和“Backgroud

16、 Box”近似，選擇右下角的“Backgroud Stripe”按鍵，然后用鼠標(biāo)沿著電泳泳道拖放形成一個(gè)狹長(zhǎng)的剪影帶（Stripe），這個(gè)剪影帶內(nèi)部的光疏密程度值順著泳道逐漸升高或降低。Quantity One根據(jù)這個(gè)Stripe可以動(dòng)態(tài)的對(duì)整張圖片的配景舉行剪影。比如泳道肇始處光疏密程度低，那末Quantity One在此處的剪影值也降低；隨著Stripe向前延長(zhǎng)，光疏密程度值逐漸升高，Quantity One也同樣不斷加大剪影的強(qiáng)度。這樣一來(lái)就能夠排除由于梯度膠帶來(lái)的配景不相符的影響因素。 5 - Quantity One的電泳泳道分析功能-創(chuàng)建泳道 前面說(shuō)過(guò)Quantity One之所以

17、強(qiáng)大是因?yàn)樗哂械挠镜?條帶軌跡定量法。此刻我們就來(lái)學(xué)習(xí)一下如安在電泳圖片上創(chuàng)建泳道（Lane）和怎樣舉行針對(duì)不同泳道的配景排除。 - - 創(chuàng)建泳道：首先打開(kāi)我們要分析的電泳圖片（以卵白質(zhì)電泳為例）。然后選擇“Lane-Auto Frame lanes”。這時(shí)候如果您的電泳圖片比較標(biāo)準(zhǔn)的話，Quantity One就會(huì)AUTO識(shí)別出每條電泳泳道的位置，而且將各個(gè)泳道的路徑用一條紅線標(biāo)畫(huà)出來(lái)； 如果您對(duì)軟件AUTO標(biāo)志的泳道不甚對(duì)勁，您可以經(jīng)由過(guò)程“Lane-Edit Frame”下級(jí)各個(gè)子菜譜提供的功能對(duì)泳道框架位置、大小等舉行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方法就是經(jīng)由過(guò)程鼠標(biāo)的拖放來(lái)使成為事實(shí)，大家可以本身體驗(yàn)

18、一下； 如果您只消分析此中幾個(gè)泳道的數(shù)據(jù)而不想其它泳道的標(biāo)志滋擾您的眼看東西假想線，您可以經(jīng)由過(guò)程“Lane-Single Lane-Remove Lane”刪除您不需要的泳道的標(biāo)志。 不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被Quantity OneAUTO識(shí)別。在不能AUTO識(shí)別的環(huán)境下，Quantity One就會(huì)彈出對(duì)話框告訴您它不能識(shí)別泳道。這時(shí)候大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上邊同樣，同過(guò)“Lane-Single Lane-Creat Lane”來(lái)使成為事實(shí)。只要用鼠標(biāo)在您的電泳圖片上順著待標(biāo)志的泳道的中軸線拖放就能夠繪制出該泳道的標(biāo)志紅線. 6 - Quantity One的電泳泳道分

19、析功能-排除配景 前面說(shuō)過(guò)Quantity One之所以強(qiáng)大是因?yàn)樗哂械挠镜?條帶軌跡定量法。此刻我們就來(lái)學(xué)習(xí)一下如安在電泳圖片上創(chuàng)建泳道（Lane）和怎樣舉行針對(duì)不同泳道的配景排除。 - - 排除配景：首先請(qǐng)大家注重，這個(gè)排除配景和前面我們?cè)凇癐mage”菜譜中施用的“Substruct Backgroud”有所不同。后者排除配景的對(duì)象是全般電泳圖片而非將各個(gè)電泳泳道的配景別離舉行排除。此刻我們要學(xué)習(xí)的這個(gè)號(hào)令可以幫忙我們別離排除各個(gè)泳道（也能夠?qū)⑷坑镜烙貌划悩?biāo)準(zhǔn)舉行排除）的不同的光疏密程度配景。這個(gè)功能對(duì)我們以后的分析影響甚大，大家一定好好學(xué)習(xí)。 首先我們要將我們的電泳圖片舉行前面談到

20、的泳道識(shí)別，不論是AUTO方式照舊手工識(shí)別。然后選擇“Lane-Lane Backgroud.”號(hào)令。選擇該號(hào)令后，鼠標(biāo)即變成一個(gè)綠顏色的“ ”，將鼠標(biāo)移到您籌算舉行配景排除的泳道（比如下圖中的第4泳道），點(diǎn)擊左鍵一下，立刻就會(huì)彈出如下圖所示的對(duì)話框。 此中“Optical Density”預(yù)示得是該泳道光疏密程度值的漫衍環(huán)境。大家會(huì)注重到這個(gè)漫衍曲線其實(shí)不是緊貼著縱軸，而是位于縱軸上方漫衍。造成這個(gè)“懸在空中現(xiàn)象”的緣故原由就是該泳道自身存在著一定的光疏密程度“配景”。這個(gè)配景的存在導(dǎo)致該泳道上各個(gè)電泳條帶之間不能處于同一水平舉行相比較；如果思量到相鄰的其它泳道更是因?yàn)椴煌渚暗拇嬖诙鵁o(wú)法相

21、比較不同泳道上的不同電泳條帶。怎樣去除這個(gè)配景呢？我們繼續(xù)看右面的“Lane Backgroud Substruction”對(duì)話框。這個(gè)對(duì)話框的上方“All Lanes”表示可以對(duì)所有泳道舉行一次性處理；下方的“Selected Lane”表示僅針對(duì)這次選中的這個(gè)泳道舉行處理（我們選中的是第4泳道）。我們用鼠標(biāo)選擇“Selected Lane”的“Lane On”選項(xiàng)。然后鄙人面的“Rolling Disk Size”里填上“5”，再按“回車(chē)”鍵。好！大家再來(lái)看看此刻“Optical Density”中出現(xiàn)了一條緊緊沿著光疏密程度曲線漫衍的深赭色曲線。這條曲線將泳道的配景與電泳條帶的光疏密程度

22、漫衍十分精確的區(qū)分清楚隔來(lái)。 大家可能會(huì)好奇這搭的“Rolling Disk Size”指得是啥子意思？我們可以將Quantity One提供的去除配景功能想象成是一個(gè)骨碌的小球。如果這個(gè)小球的半徑越小，那末它沿著光疏密程度曲線骨碌時(shí)滾過(guò)的路徑就越發(fā)精致，具體反映在深赭色曲線的軌跡越發(fā)靠近玄帶顏色的光疏密程度漫衍曲線的基線。因此從理論上來(lái)講“Rolling Disk Size”的取值越小，它的去除配景效果越好。大家可以試著選擇一個(gè)較大的值比如80，再來(lái)看看此時(shí)深赭色曲線的軌跡。固然也不能取過(guò)小的值。因?yàn)槿绻≈颠^(guò)小，大家可以想象這個(gè)十分微小的球就會(huì)滾入光疏密程度曲線內(nèi)部，造成有用陽(yáng)性信號(hào)的損失

23、。個(gè)人感覺(jué)520是一個(gè)比較好的取值范圍. OK！我們?cè)僭凇癓ane Backgroud Substruction”對(duì)話框的最下方鉤選“Show Lane Trace with Backgroud Substructed”，再來(lái)看看是否泳道上所有的配景都被消弭了？各個(gè)電泳條帶是否純粹聯(lián)合到縱軸上在同一水平舉行比較了？ 我們對(duì)其它泳道也能夠依葫蘆畫(huà)瓢舉行近是的配景排除工作。如果大家覺(jué)得可以施用同樣的標(biāo)準(zhǔn)，即不異的“Rolling Disk Size”舉行排除，那末我們可以在“Lane Backgroud Substruction”對(duì)話框入選擇上方的“All Lanes On(same level)

24、”選項(xiàng)。然后在“Rolling Disk Size”中填上一個(gè)合適的值，點(diǎn)擊“Done”按鍵確認(rèn)就能夠了。此時(shí)該電泳圖片上所有的泳道都以不異的標(biāo)準(zhǔn)舉行了配景去除。不信你可以本身將鼠標(biāo)點(diǎn)擊其它泳道（比如第8道或第1道），你會(huì)發(fā)明所有泳道的配景均已去除。 7 - Quantity One的電泳泳道分析功能-相比較泳道 剛才我們已經(jīng)對(duì)電泳圖片上的泳道舉行了識(shí)別和配景去除。此刻我們可以利用Quantity One提供的泳道相比較功能對(duì)同一張凝膠相片上的不同泳道舉行相比較，看看每條泳道上電泳條帶的漫衍環(huán)境。 - - 泳道相比較：首先將打開(kāi)的電泳相片舉行前面談到的泳道識(shí)別和去除配景步調(diào)。然后選擇“Lane

25、-Compare Lanes”號(hào)令，鼠標(biāo)變成“藍(lán)色感慨號(hào)”然后將鼠標(biāo)移動(dòng)到您但愿舉行相比較的泳道上（比如下圖的第3泳道），左鍵點(diǎn)擊，Quantity One就會(huì)立刻探出一張玄色配景的“Compare Lanes”對(duì)話框。在這個(gè)對(duì)話框中紅色的曲線代表您選擇的泳道的光疏密程度漫衍曲線。曲線的波峰部門(mén)表示位于泳道上的不同電泳條帶；波峰的凹凸象征電泳條帶光疏密程度值的大??；波峰的寬窄象征電泳條帶的寬度；波峰由左至右表示各個(gè)電泳條帶順著泳道由后向前的漫衍。 大家請(qǐng)注重這個(gè)紅色曲線。它不僅只提供給我們關(guān)于泳道上光疏密程度的漫衍環(huán)境，更重要的是鄙人一步我們對(duì)電泳條帶舉行定量的時(shí)辰，我們將以每個(gè)波峰的曲線下平

26、面或物體表面的大作為定量的標(biāo)準(zhǔn). 我們還可以用鼠標(biāo)點(diǎn)擊其它我們感興趣的泳道（比如下圖中第六、9、14泳道），這時(shí)候再轉(zhuǎn)到“Compare Lanes”對(duì)話框我們會(huì)發(fā)明Quantity One已經(jīng)幫我們用不同顏色在同一張圖片上繪制出了這4條泳道的相比較圖。是不久短常PP？ 8 - Quantity One的電泳條帶分析功能-創(chuàng)建條帶 前面我們已經(jīng)識(shí)別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們起頭研究電泳條帶的問(wèn)題。首先在這搭明確兩個(gè)名詞翻譯：“Lane”指電泳泳道；“Band”指電泳條帶。鄙人類(lèi)社會(huì)文化中一例施用這兩個(gè)英文名詞來(lái)表示這兩個(gè)意思。 - - 電泳條帶的識(shí)別：和前面研究Lane同樣，首先我們要對(duì)

27、Lane上的Band舉行識(shí)別。識(shí)別方式同樣分為AUTO識(shí)別和人工識(shí)別。AUTO識(shí)別的時(shí)辰選擇“Band-Detect Bands.”號(hào)令。這時(shí)候Quantity One會(huì)AUTO彈出一個(gè)“Detect Bands”的對(duì)話框（如下圖）。 首屆用Quantity One的朋友可能會(huì)發(fā)明您的Bands識(shí)別以后僅只是畫(huà)出了一條紅色的粗線，而在上邊的演習(xí)圖片中倒是上下括號(hào)的形式。其實(shí)大家可以在“Band-Band Attributes”選項(xiàng)中設(shè)置Bands的預(yù)示形式。鄙人方的“Style”選項(xiàng)卡入選擇“Brackets”就會(huì)將原來(lái)的粗線改為括號(hào)形式了. 在上邊的對(duì)話框中，我們可以指定識(shí)別的參量。 如果要

28、AUTO識(shí)別所有Lanes上的Bands就鉤選Lands后面的“All”選項(xiàng)；如果僅只想AUTO識(shí)別某一條Lane上的Bands就鉤選“One”，然后在后面的輸入框中填上您想識(shí)別的泳道號(hào)碼； 如果僅只想識(shí)別泳道上部門(mén)光疏密程度值最強(qiáng)的Bands，可以在“Bands”后面的選項(xiàng)入選擇“Limit”，然后填上響應(yīng)的數(shù)目（比如10）。Quantity One就會(huì)僅識(shí)別該泳道上光疏密程度最大的10條Bands； 如果您發(fā)明AUTO識(shí)別的Bands寬度太窄，圈定Band的紅色括號(hào)內(nèi)范圍小于玄色的光疏密程度影。此時(shí)可以施用“Lane Width”號(hào)令來(lái)調(diào)整Bands識(shí)別的寬度。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“Lane Wid

29、th”后面的向上箭頭就會(huì)發(fā)明紅色括號(hào)逐漸變寬，最后要求其范圍略為寬過(guò)其包繞的Band影跡； 如果您發(fā)明AUTO識(shí)別功能沒(méi)有識(shí)別您想要的Band或誤識(shí)別了您不想要的Band，您還可以施用上邊的工具欄舉行調(diào)整。將您的鼠標(biāo)指向每個(gè)圖標(biāo)，Quantity One就會(huì)懂得彈出一個(gè)*的提示信息告訴您這個(gè)按鍵的功能。在此再也不繼續(xù)闡述了。 9 - Quantity One的電泳條帶分析功能-高斯建模與結(jié)果分析 此刻我們已經(jīng)完成為了泳道識(shí)別、配景去除、條帶識(shí)別的任務(wù)。接下來(lái)我們要對(duì)Bands舉行一些處理，然后就能夠舉行最終的結(jié)果分析了。 - - 高斯建模：大家學(xué)過(guò)計(jì)數(shù)學(xué)知識(shí)后都懂得高斯（Gauss）漫衍是個(gè)啥

30、子意思，在此我就未幾作解釋了。Quantity One認(rèn)為一個(gè)理想狀態(tài)的Band內(nèi)部的光疏密程度漫衍應(yīng)該也服從高斯曲線的特性，正如前面向大家展示的3D Viewer中的圖片那樣。在我們同樣平常的電泳泳道中時(shí)常出現(xiàn)幾個(gè)相隔很近的Bands（即份子量很接近的幾個(gè)卵白或核酸）在泳道的某個(gè)區(qū)域成串出現(xiàn)。此時(shí)我們很難經(jīng)由過(guò)程會(huì)自等高線的措施精確的描繪出每條Band自力的輪廓。這個(gè)時(shí)辰我們就需要對(duì)這些擁擠在一路的Bands舉行高斯建模處理。Quantity One能夠依據(jù)高斯曲線的特性，配合有用的配景去除，將各條緊靠在一路、界限彼此融合的Bands描繪成具有自力光疏密程度漫衍的彼此疊合的曲線。如下圖所示，

31、原來(lái)彼此融合的22、23兩條Bands經(jīng)過(guò)高斯建模然后變成為了兩個(gè)具有自力漫衍曲線，彼此疊合的Bands。 高斯建模必需建立在有用的泳道配景去除然后。配景去除的方法可以參見(jiàn)我們前面的方法，即經(jīng)由過(guò)程“Lane-Lane Backgrouds”的方式舉行去除配景。去除配景的時(shí)辰最佳選擇Rolling Disk Size小一些的方案。這樣配景去除后的光疏密程度漫衍曲線和高斯建模后的光疏密程度漫衍曲線才氣比較好的吻合。另外高斯建模其實(shí)不是一個(gè)必需的步調(diào)。它僅只在出現(xiàn)多條Bands緊密擺列在一路，以至于無(wú)法分辯它們之間的間隔的時(shí)辰才最有用。如果Bands在泳道上松散的漫衍則可以不施用高斯建模. 那末怎

32、樣舉行高斯建模呢？很簡(jiǎn)單！只要執(zhí)行“Band-Gauss Model Bands.”號(hào)令就能夠，執(zhí)行后Quantity One回彈出一個(gè)對(duì)話框問(wèn)您要對(duì)那條泳道舉行高斯建模。請(qǐng)鉤選“One”，然后再輸入需要建模的泳道代碼就能夠了（比如下圖中的第2泳道）；如果選擇了“All”則對(duì)所有泳道舉行高斯建模，固然建模這么多泳道會(huì)費(fèi)一點(diǎn)兒時(shí)間了。 - - 察看結(jié)果：執(zhí)行完高斯建模以后施用“Band-Band Information”號(hào)令來(lái)察看結(jié)果。方法是將變成藍(lán)色驚嘆號(hào)的鼠標(biāo)移到剛才已經(jīng)識(shí)別的Band的部位，一個(gè)詳細(xì)的“Band Information”信息框就會(huì)立刻彈出來(lái)（見(jiàn)下圖）。在這幅圖中我們必需注重

33、的是“Trace”和/或“Gauss Model Trace”，因?yàn)槲覀儎偛判量嗔税胩炀褪菫榱说玫竭@個(gè)數(shù)據(jù)。這個(gè)數(shù)據(jù)表示的就是Band光疏密程度漫衍曲線下平面或物體表面的大，也就是Quantity One用來(lái)表達(dá)Band內(nèi)份子總量的方式。在這個(gè)信息框中還有一些重要信息比如“Mol Wt”（份子量）；“Quantity/Units”等此刻照舊空缺，咱們下以后的分析步調(diào)中將逐漸填滿(mǎn)它們。 Quantity One有一點(diǎn)兒讓人感到很半大白。它的“Trace”和“Gauss Model Trace”都是表示曲線下平面或物體表面的大的，可是施用的單元是OD*mm；而在另外的等高線定量方法中，同樣是表示某

34、個(gè)區(qū)域平面或物體表面的大的單元倒是OD*mm2. 下面讓我們回過(guò)甚來(lái)看看高斯建模然后電泳圖片的分析結(jié)果到盡頭發(fā)生了啥子變化。首先是一張沒(méi)有舉行高斯建模的圖片，大家可以看到在這張圖片中的白框部門(mén)，第2泳道的第6個(gè)band的光疏密程度曲線*部門(mén)其實(shí)不呈高斯對(duì)稱(chēng)（少了一部門(mén)不是？）。這是因?yàn)樗徊块T(mén)和鄰近的Band彼此融合在一路了。 此刻再來(lái)相比較一下經(jīng)過(guò)高斯建模后的電泳圖片分析結(jié)果。照舊在不異位置，這時(shí)候代表第2泳道第6個(gè)Band的*光疏密程度曲線是否呈完備的高斯對(duì)稱(chēng)了？而且后面的“Gauss Model Trace”也再也不是“N.A”，而變成為了“0.717 OD”，相比較上邊的“Trace”

35、=0.693 OD，大家想想為啥子要大一些呢？ ！10 - Quantity One的電泳條帶分析功能-份子量預(yù)先推測(cè) 前面我們和大家學(xué)習(xí)了用Quantity One舉行電泳條帶定量的基本方法。此刻我們暫時(shí)轉(zhuǎn)移眼看東西假想線來(lái)探討一下另外一個(gè)功能，份子量預(yù)先推測(cè)。這個(gè)功能對(duì)卵白質(zhì)而言是份子量預(yù)先推測(cè)，對(duì)核酸而言就是核酸大小的預(yù)先推測(cè)了。下面我們照舊以卵白質(zhì)為例來(lái)學(xué)習(xí)。 - - 份子量預(yù)先推測(cè)：首先大家必需懂得的是份子量的預(yù)先推測(cè)是建立在泳道和條帶都已經(jīng)創(chuàng)建好的根蒂根基上。我們只是人為的為一些泳道上的條帶加上一個(gè)已知的標(biāo)準(zhǔn)，然后經(jīng)由過(guò)程不同泳道和條帶之間的相比較繪制回歸曲線，經(jīng)由過(guò)程回歸曲線的走

36、歷來(lái)預(yù)先推測(cè)特別指定條帶上的份子的份子量。固然如果我們能夠在一次電泳中多跑幾條不同份子量身分的marker，肯定是能夠提高我們預(yù)先推測(cè)的準(zhǔn)確性。 下面我們談?wù)勗鯓硬僮鳌Ｔ谝呀?jīng)創(chuàng)建好泳道和條帶的圖片上，執(zhí)行“Match-Standard”號(hào)令，在彈出的“Select Standards”選項(xiàng)卡入選擇一個(gè)合適的marker。如果您本身已經(jīng)跑了Marker，那末請(qǐng)選擇“New Standard”創(chuàng)建您本身的marker，然后在彈出的“Standard”菜譜中輸入您的Marker的份子量。如下圖在“Standard”中輸入一個(gè)名稱(chēng)，然后鄙人面的表格中輸入各個(gè)Marker的份子量和名稱(chēng)。 輸入完成以后用

37、鼠標(biāo)點(diǎn)擊“Type”下面的小箭頭（上圖鼠標(biāo)指向的位置），然后把變成綠顏色加號(hào)的鼠標(biāo)移動(dòng)到您的Marker泳道上響應(yīng)的band。例如上圖中200KD就移動(dòng)到第15泳道的200KD的位置，以此類(lèi)推，將每個(gè)Marker都標(biāo)志上響應(yīng)的數(shù)字。標(biāo)志完成后，Maker泳道上的Bands就會(huì)變成藍(lán)色。 如果您有多條Marker泳道，您可以再多表記幾條以提高軟件預(yù)先推測(cè)的準(zhǔn)確性。此刻我們執(zhí)行“Match-Standard Curve”，然后用鼠標(biāo)隨便點(diǎn)擊我們想要了解的泳道，Quantity One立刻就會(huì)為我們預(yù)示出一條曲線，當(dāng)中還有一個(gè)小的對(duì)話框“Std.Curve Options for Proteins”

38、，在這個(gè)對(duì)話框中“Regression Model”選擇“Point to Point Semi-log”或“Elder-Southern”這兩種回歸方式；然后鉤選當(dāng)中的“Show Numerical data of Points”，這時(shí)候再看那條曲線上是否已經(jīng)標(biāo)注了很多數(shù)字？這些數(shù)字就是水平方向上對(duì)應(yīng)的Bands的份子量了。 11 - Quantity One的電泳條帶分析功能-創(chuàng)建定量標(biāo)準(zhǔn) 上邊說(shuō)明說(shuō)過(guò)，在Band Information中除了“trace”和“gauss model trace”之外我們還有幾個(gè)項(xiàng)目沒(méi)有填入數(shù)據(jù)。這些其時(shí)未填入的數(shù)據(jù)其實(shí)是“Mol.wt”和“Quantit

39、y/Unit”這2項(xiàng)。剛才我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了怎樣預(yù)先推測(cè)份子量，大家此刻再用“Band-Band Information”號(hào)令看看您感興趣的Band，是否“Mol.wt”已經(jīng)被填上數(shù)字了？此刻只剩下“Quantity/Unit”，讓我們起頭學(xué)習(xí)怎樣測(cè)定具體的定量值（原來(lái)測(cè)定的僅只是光疏密程度值和Band之間的事物的量的比，而沒(méi)有落實(shí)到具體的實(shí)際數(shù)字）。 - - 創(chuàng)建定量標(biāo)準(zhǔn)：所謂創(chuàng)建“定量標(biāo)準(zhǔn)”其實(shí)近似于剛才我們?cè)O(shè)置的份子量Marker。只不外這搭我們用已知Band的事物的量做為Marker，就像用5ul的DL2000跑電泳，每條Band含50ng的雙鏈DNA。具體操作如下：執(zhí)行“Analysis

40、-Quantity Standards”，在彈出的“Calibration Curve”對(duì)話框入選擇“Creat New”，在隨后的“Quantity Standards”對(duì)話框中填寫(xiě)一系列相干信息。重要的信息包孕： 1.“Units”：指作為marker的事物的量的單元，例如ng，ug，mg等等。 2.“Measure”：指對(duì)Maker和待測(cè)Band的丈量方式。點(diǎn)擊“Measure”按鍵后可以選擇“Trace Density”、“Contour Density”、“Peak Density”和“Average Density”。如果您前面的分析接納的是軌跡法定量的話可以選擇“Trace De

41、nsity”；如果您接納的是等高線法定量可以接納“Contour Density”。 3.“Select”：在“Select”后面有三個(gè)選項(xiàng)，Band、Match、Lane。選中此中一個(gè)選項(xiàng)比如“band”，然后將變成向上小箭頭的鼠標(biāo)指向您本身跑的Marker條帶，點(diǎn)擊左鍵，就會(huì)發(fā)明此時(shí)該Band已經(jīng)變成*。您可以多點(diǎn)選幾個(gè)作為Marker的Bands（至少3個(gè)，越多越好），然后回到“Quantity Standards”框。這時(shí)候框下部的表格變成可填寫(xiě)狀態(tài)，在“Quantity ug”中填入響應(yīng)的數(shù)字，每個(gè)數(shù)字對(duì)應(yīng)您剛才標(biāo)志的作marker的Bands。后面的“Dilution factor”項(xiàng)可暫時(shí)不管；其它兩項(xiàng)“Lane”和“Match”首要用來(lái)一次性填入一條泳道上所有的