斑馬魚(yú)卵液中凝菌物質(zhì)分離純化及分析

1、斑馬魚(yú)卵液中凝菌物質(zhì)分離純化及分析 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)生物化學(xué)方法，對(duì)斑馬魚(yú)卵中具有與細(xì)菌結(jié)合活性的物質(zhì)進(jìn)行分離純化，SDS-PAGE電泳后切膠，對(duì)目的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步質(zhì)譜分析。2、 實(shí)驗(yàn)原理1、 SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開(kāi)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而與電荷和分子形狀無(wú)關(guān)。2、 肽指紋圖譜測(cè)定(Peptide Mass Fingerprinting, PMF) 是對(duì)蛋白酶解或降解后所得多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法。質(zhì)譜分析所得肽斷與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)的理論肽

2、斷進(jìn)行比較，判斷出所測(cè)蛋白是已知還是未知。由于不同的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列，不同蛋白質(zhì)所得肽斷具有指紋特征。采用肽指紋譜的方法已對(duì)多種蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，儀器主要由兩部分組成：基質(zhì)附助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測(cè)定。TOF的原理是離

3、子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比 ，檢測(cè)離子。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段，并正扮演著越來(lái)越重要的作用。3、 試驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚(yú)(Danio rerio)購(gòu)自臺(tái)東，28于魚(yú)缸中培養(yǎng)，24小時(shí)通入無(wú)菌空氣，每天換水進(jìn)行養(yǎng)育。 大腸桿菌（E.coli），金黃色葡萄球菌（S.aureus）來(lái)自微生物實(shí)驗(yàn)室。2、 實(shí)驗(yàn)試劑 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：碧云天 P0012 勻漿緩沖液：0.02M Tris-HCl緩沖液 含1

4、00mM NaCl pH=8.0 緩沖液：0.02M Tris-HCl緩沖液 含150mM NaCl 10mM CaCl2 pH=8.0 緩沖液：0.02M Tris-HCl緩沖液含4M尿素 pH=8.0 LB培養(yǎng)基：1000ml去離子水 10g胰化蛋白胨 5g酵母提取物 10g NaCl pH=7.0 15psi高壓下蒸汽滅菌20min4、 實(shí)驗(yàn)步驟1、斑馬魚(yú)卵的獲得及卵液制備 將親魚(yú)公、母分開(kāi)飼喂23天（相互之間能夠看到）。喂養(yǎng)時(shí)，照明14h黑暗10h交替進(jìn)行，定時(shí)喂以人工顆粒狀餌料。采卵時(shí)，取健康性成熟的斑馬魚(yú)，按雌雄2：1的比例放入交配缸內(nèi)，28恒溫過(guò)夜，次日68時(shí)拔出隔板，獲得受精卵

5、。 將受精卵收集起來(lái)，用勻漿緩沖液將卵沖洗干凈，用槍吸取多余水分。用研磨棒將卵搗碎，4 15000g 離心30min，取上清，即為卵液。2、 兩種細(xì)菌（G+和G-）的培養(yǎng)準(zhǔn)備以及菌濃度測(cè)定 將E.coli(G-)和S.aureus（G+）分別接種到LB培養(yǎng)基中。37培養(yǎng)6h，將菌液室溫3000g離心5min，棄去上清，收集菌體。用0.02M Tris-HCl緩沖液重懸菌體，然后3000g離心5min，共洗滌3次，最后用100ul緩沖液重懸菌體。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板法測(cè)定菌濃度。3、菌卵孵育，脫洗，超濾濃縮 向上述兩種菌體懸液中加入100ul卵液，混勻后，室溫溫和搖動(dòng)3h，其中對(duì)照組用緩沖液代替卵液，以

6、相同條件進(jìn)行孵育。孵育后，將菌液與卵液/緩沖液的混合物3000g離心5min，收集菌體后用0.02M Tris-HCl緩沖液重懸菌體，洗滌3次。用100ul緩沖液重懸菌體，室溫?fù)u動(dòng)1h，洗下菌上結(jié)合的蛋白。室溫下3000g離心5min，取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)超濾濃縮，并用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。4、SDS-PAGE電泳及分析 配制12%SDS-PAGE凝膠，安裝好電泳儀，在槽中加入SDS電極緩沖液。 取40ul樣品，加入loading10ul，沸水浴8min。按一定順序在加樣孔中加入樣品。 打開(kāi)電源將電壓調(diào)到120v，待樣品跑過(guò)壓縮膠后調(diào)到200v至樣品電泳到膠底部。 取下凝膠，加入染色液，搖床30

7、min。待條帶清晰后，加入脫色液過(guò)夜。 在燈箱下觀察。拍照，分析。5、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果12%的SDS-PAGE:與陰性對(duì)照組相比，在兩種菌的實(shí)驗(yàn)組中116kd/116-66.2kd/35-25kd處均出現(xiàn)了明顯的三條帶。對(duì)大腸桿菌做進(jìn)一步分析：大腸桿菌數(shù)目（個(gè)/ml）1.4625*109卵液蛋白濃度（mg/ml）6.6092實(shí)驗(yàn)組（E+）蛋白濃度（mg/ml）2.7255對(duì)照組（E-）蛋白濃度（mg/ml）3.046110%的SDS-PAGE： 將116kd處的蛋白樣品切膠，送往華大基因進(jìn)行質(zhì)譜和肽指紋圖譜鑒定。6、 分析和討論 如圖所見(jiàn)，斑馬魚(yú)卵液（稀釋10倍）中含有多種蛋白質(zhì)，其中有許多母源性免

8、疫因子,如IgM、溶菌酶、凝集素和補(bǔ)體C3等。其對(duì)斑馬魚(yú)受精卵在充滿大量微生物的體外環(huán)境中發(fā)育，抵抗微生物感染而起到了重要的免疫保護(hù)作用。與陰性對(duì)照組相比，在實(shí)驗(yàn)組中116kd/116-66.2kd/35-25kd處出現(xiàn)了明顯的三條帶。將116kd處的蛋白樣品切膠，送往華大基因進(jìn)行質(zhì)譜和肽指紋圖譜鑒定。由于分析周期較長(zhǎng)，結(jié)果尚未出來(lái)。有資料表明，二齡草魚(yú)能與WAL兔抗血清反應(yīng),產(chǎn)生特異性條帶,分子量約為25000；甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)基因片段作為探針,與二齡草魚(yú)和45月齡草魚(yú)mRNA雜交，表達(dá)豐度較高。同時(shí)，另有資料表明，MBL分子量大約在30kd左右，猜測(cè)斑馬魚(yú)卵中具有與細(xì)菌結(jié)合能力的物質(zhì)中可能有凝集素類物質(zhì)。質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn):很高的靈敏度能為亞微克級(jí)試樣提供信息,能最有效地與色譜聯(lián)用,適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測(cè)定,同時(shí)具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性，同時(shí)具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性。由于質(zhì)譜法所具有的這些特點(diǎn)使它成為解決生命科學(xué)中分析研究的強(qiáng)有力手段，在未知蛋白檢測(cè)方面具有廣泛的應(yīng)用。例如：Johnston一Wilson等聯(lián)合運(yùn)用2D PAGE與質(zhì)譜技術(shù)在精神分裂癥、抑郁癥、雙相障礙