抑制性消減雜交技術(shù)克隆腎癌差異表達(dá)基因

1、抑制性消減雜交技術(shù)克隆腎癌差異表達(dá)基因【摘要】目的應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建人腎癌組織與正常腎組織差異表達(dá)的 cDNA消減文庫，并從中克隆鑒定出腎癌特異性表達(dá)的新基因。方法分別從腎癌及正常腎組織中提取mRNA并合成cDNA，經(jīng)酶切后將腎癌cDNA分為兩組，分別與兩種不同的接頭銜接，再與正常腎組織(cDNA)進(jìn)行兩次消減雜交及兩次抑制性PCR，將產(chǎn)物與T/A載體連接構(gòu)建成功 cDNA消減文庫，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌進(jìn)行文庫擴(kuò)增,隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行酶切、測序分析。結(jié)果構(gòu)建成功具有高消減效率的人腎癌cDNA消減文庫，非特異性的cDNA片段被有效地消減，特異表達(dá)的 cDNA得到富集。文庫擴(kuò)增后得到350個白色克

2、隆，隨機(jī)挑取200個制備質(zhì)粒并酶切分析，其中 190個均得到50400bp插入片段。隨機(jī)挑取15個插入片段測序分析表明所獲得的 cDNA片段均為未知新基因片段。結(jié)論應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)所構(gòu)建的人腎癌 cDNA消減文庫為大批量篩選、克隆腎癌特異性表達(dá)的未知新基因奠定了基礎(chǔ)。初步篩選出的新基因片段為研究基因功能及其臨床意義提供了依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】腎腫瘤癌雜交文庫克隆 Suppression subtractive hybridization for cloning of renal cell carcinoma relative genesZHANG Qiang,ZHANG Zhiwen,GONG

3、 Kan,et al.Insititute of Urology,The First Hospital of Peking University Beijing 100034,China【Abstract】ObjectiveTo construct a cDNA subtractive library of human renal cell carcinoma (RCC) with suppression subtractive hybridization technique.The library contains only the differently expressin cDNAs b

4、etween RCC and normal kidney.MethodsPoly (A)+RNA were isolated from RCC and normal kidney tissues.Single-strand cDNAs and double-strand cDNAs were synthesized in turn.After enzyme restriction,cDNAs 600bp were obtained.RCC cDNAs were then divided into two groups and li-gated to the specific adaptor l

5、 and adaptor 2 respectively.After RCC cDNAs were hybridized with normal kidney cDNA twice and underwent two times of nested PCR and was then connected with arms of T/A plasmid vectors to set up the subtractive library.Amplification of the library was carried out with E.coli strain Top 10F.ResultsHum

6、an RCC subtractive library with high subtractive efficiency was set up successfully.The amplified library contains 350 positive clones.Random analysis of 200 clones with enzyme restriction shows that 190 plasmids in the clones contain 50400bp inserts.Sequence analysis were performed in 15 clones.All

7、 of the sequences are unknown before.ConclusionsThe cDNA subtractive library of human RCC is a highly efficient one and lays solid foundation for screening and cloning new and specific oncogenes or tumor suppressor genes of RCC.The novel genes cloned proved to be an important clue for researching th

8、e mechanism of occurrence and development of RCC.【Key words】Kidney neoplasmsCarcinomaHybridizationLibraryClone腎癌的發(fā)生發(fā)展與多種基因的突變與表達(dá)異常有關(guān)。我們首次應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH）技術(shù)構(gòu)建由腎癌和正常腎組織之間差異表達(dá)的 cDNA片段組成的 cDNA消減文庫，并從中克隆出腎癌特異表達(dá)的未知新基因片段，為今后進(jìn)一步研究腎癌特異表達(dá)基因的功能提供了依據(jù)。材料和方法一、腎癌和正常腎組織來源患者，男，52歲。CT、MRI、B超均診斷為左腎中上極癌，3cm2cm，未轉(zhuǎn)移。行左腎癌根治

9、術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為左腎中上極透明細(xì)胞癌，伴出血及囊性變， Fuhrman分級以G2為主，部分為G1，Robson 分期為T2，腎盂受壓變形。同時取腫瘤組織及遠(yuǎn)離腫瘤 5cm 以上的癌旁組織（經(jīng)病理證實(shí)無癌變的相對正常組織），標(biāo)本以液氮處理，-80凍存。二、生化試劑mRNA Purification試劑盒為美國 Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品；PCR-Select cDNA Subtraction試劑盒, 50PCR Enzyme Mix 、Advantage PCR Cloning試劑盒為美國 Clontech公司產(chǎn)品,限制性內(nèi)切酶EcoRI為美國 Promega公司產(chǎn)品。質(zhì)粒載體

10、為PTAdv 質(zhì)粒，3 890bp，抑制性 PCR產(chǎn)物以 T/A方式接入載體。文庫擴(kuò)增使用感受態(tài)大腸桿菌 Top10F。聯(lián)合應(yīng)用氨芐青霉素（ 50mg/L）及半乳苷酶互補(bǔ)作用顯色反應(yīng)（顯色劑為 X-gal/IPTG，Gibco公司產(chǎn)品）篩選陽性克隆。 PCR 擴(kuò)增儀為Perkin Elemer DNA Thermal Cycler 480。三、抑制性消減雜交1.腎癌及正常腎組織po1y（A）+ RNA的提取：腎癌及正常腎組織各200mg，使用mRNA Purification試劑盒，層析法直接提取po1y（A）+ RNA ,按說明書操作并進(jìn)行定性定量分析。2.雙鏈cDNA（dscDNA ）合成

11、及腎癌 dscDNA 的接頭銜接：按文獻(xiàn)1方法進(jìn)行，取po1y（A）+ RNA 4l(2g)和cDNA合成引物1l，在白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶（200U）及dNTP作用下42延伸90min后立即加入DNA聚合酶1、RNase H、EcoliDNA連接酶、dNTP組成總體積為80l的反應(yīng)體系，16孵育2h后加入 6U T4DNA聚合酶，16再反應(yīng)30min后合成 ds cDNA。將合成的ds cDNA 43.5l經(jīng)15U RsaI在37酶切反應(yīng)5h。以腎癌為試驗(yàn)方，正常腎為參照方，試驗(yàn)方ds cDNA以16稀釋后，分為兩組，各2l，分別與 adaptor 1、2（接頭1、2）連接，16反應(yīng)

12、12h后進(jìn)行連接效率檢測。3.兩次消減雜交及兩次抑制性PCR：在鑒定連接效率滿意（25%）后，將連接有adaptor 1和adaptor 2的試驗(yàn)方ds cDNA 1.5l 分別與1.5l參照方ds cDNA在68下雜交8h后，立即將經(jīng)過第一次消減雜交的兩組體系混合，另加新變性的參照方cDNA 1l,68雜交12h，稀釋。取 1l稀釋（1：200 ）后的第二次雜交后產(chǎn)物，在 50advantage klen Taq聚合酶作用下，以adaptor 1及adaptor 2的外側(cè)序列分別為5及3引物，進(jìn)行第1次 PCR擴(kuò)增，取第一次PCR產(chǎn)物1l，以adaptor 1及adaptor 2的內(nèi)側(cè)序列分

13、別為5及3的巢式PCR引物，進(jìn)行第二次 PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行 PCR產(chǎn)物消減效率檢測（將未經(jīng)抑制消減的腎癌 cDNA同時進(jìn)行 PCR對照）。四、cDNA消減文庫的構(gòu)建及克隆鑒定分析按文獻(xiàn)2方法，取 3l PCR產(chǎn)物及2l PT-Adv線性化質(zhì)粒載體，在1l T4 DNA連接酶的作用下，14反應(yīng)12h后，-20保存。取2l連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)染50l感受態(tài)大腸桿菌Top10F，225 轉(zhuǎn)/分搖菌1h，取200l菌液種植于含氨芐青霉素的LB/X-gal/IPTG培養(yǎng)板上，37培育18h。計(jì)數(shù)培養(yǎng)板中直徑1mm清晰的白色及藍(lán)色菌落數(shù)，隨機(jī)挑取200個白色菌落，按文獻(xiàn)3方法制備質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切分析。隨機(jī)挑取1

14、5個含插入片段的質(zhì)粒，用 M13 正向引物測序，引物合成及序列分析由賽百勝公司代理。結(jié)果一、 mRNA的定性定量分析紫外分光檢測顯示共提取腎癌及正常腎poly(A)+RNA分別為5.08g和5.12g，吸光度A260吸光度A 2801.90，1.0瓊脂糖凝膠電泳見 mRNA為 0.5kb清晰慧尾片狀條帶，證實(shí)mRNA質(zhì)優(yōu)量足（1）二、 ds cDNA兩端連接效率檢測將連接有adaptor l和adaptor 2的兩組腎癌ds cDNA分別用G3PDH3、5引物及以 G3PDH3引物和接頭部序列為5引物進(jìn)行30個循環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示兩組腎癌ds cDNA連接效率均

15、80，即80以上 dscDNA已與接頭連接（2）。三、 cDNA消減文庫消減效率的鑒定分別取ll抑制性 PCR產(chǎn)物為模板，用看家基因G3PDH及腎癌中高表達(dá)而正常腎中表達(dá)很低甚至不表達(dá)的癌基因c-myc片段4的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系30l，分別在28、33、38、43次循環(huán)結(jié)束時從體系中吸取5l進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果顯示：與非抑制性 PCR產(chǎn)物相比，抑制性 PCR產(chǎn)物中非特異性表達(dá)G3PDH基因產(chǎn)物大大減少，而特異性高表達(dá)的c-myc基因大量富集，說明所構(gòu)建的消減文庫具有很高的消減效率。 1mRNA凝膠電泳分析結(jié)果mRNA呈清晰慧尾狀條帶 2ds cDNA兩端連接效率凝膠電泳鑒定第1、

16、2道為與adaptor l連接組，第3、4道為與adaptor 2連接組，第1、3道以G3PDH3、5引物，第2、4道以G3PDH3引物和接頭部序列為5引物，結(jié)果顯示灰度比值：第2道/第1道、第4道/第3道均80% 3質(zhì)粒酶切電泳分析結(jié)果隨機(jī)挑取的克隆中，均載有50400bp大小的插入片段四、cDNA消減文庫擴(kuò)增及克隆的序列分析鑒定擴(kuò)增后cDNA消減文庫包含約350個白色克隆和40個藍(lán)色克隆，克隆飽滿清晰。隨機(jī)挑取200個白色克隆，制備質(zhì)粒后，予EcoRl酶切分析，190個克隆均載有50400bp大小插入片段（3），與理論設(shè)計(jì)大小相符。測序表明隨機(jī)挑取的15個cDNA插入片段大小為150300

17、bp，經(jīng)GENE BANK（/BLAST）鑒定均為未知新序列。討論腎癌是一種生物學(xué)行為多變腫瘤，病因至今不清，近年來遺傳學(xué)研究表明抑癌基因VHL、WTI的突變，原癌基因c-myc和EGFR mRNA的過表達(dá)與腎癌發(fā)生有關(guān)，但均非腎癌特異性表達(dá)的基因5-7。目前研究的熱點(diǎn)集中在對腎癌特異性基因的克隆與鑒定。方法為構(gòu)建一般的基因組文庫或cDNA文庫并進(jìn)行篩選，但因其特異性差，篩選陽性率低，故進(jìn)展緩慢。Diatchenko等1在抑制性 PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)明了抑制性消減雜交技術(shù)（SSH），并成功地構(gòu)建了睪丸腫瘤特異性 cDNA消減文庫，并從隨機(jī)挑選的62個克

18、隆中，鑒定出42個睪丸腫瘤特異的新基因。此后SSH技術(shù)相繼應(yīng)用于乳腺癌、腎上腺癌等腫瘤特異性基因的克隆8，均取得成功，但至今尚無腎癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤消減文庫構(gòu)建及基因克隆的報(bào)道。抑制性消減雜交技術(shù)主要通過消減雜交將待比較雙方（實(shí)驗(yàn)方，如腎癌）和參照方mRNA共同的部分消減，再通過抑制性 PCR 特異性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方特異表達(dá)的 cDNA片段使實(shí)驗(yàn)方DNA中特異表達(dá)基因的cDNA得到大量的富集。它所構(gòu)建的消減文庫較普通的基因組文庫或 cDNA文庫具有兩大優(yōu)點(diǎn)：(1)高度特異性：通過對cDNA片段裝上接頭，兩輪消減雜交，兩輪抑制性PCR，大量特異擴(kuò)增代表差異表達(dá)的cDNA片段，抑制非特異性片段，使各種消減

19、文庫特異性達(dá)60951，9，10，大大減少了進(jìn)一步篩選的復(fù)雜性。(2)有歸一化（normalization）過程，在第一次雜交過程中，由于雜交二級動力學(xué)的原因，高豐度的轉(zhuǎn)錄物易退火，使高、低豐度序列濃度一致，實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過一輪消減即可對稀少片段幾個分子富集1 0005 000倍，對低豐度的差異表達(dá)基因也能有效地克隆9，11,此為普通基因組文庫和cDNA文庫無法達(dá)到的。我們應(yīng)用抑制性消減雜交方法，經(jīng)嚴(yán)格檢驗(yàn)成功地用腎癌組織構(gòu)建了高特異性的人腎癌cDNA消減文庫，并且排除了組織相容性抗原基因差異的干擾。經(jīng)過消減效率鑒定表明，看家基因G3PDH非特異性表達(dá)的cDNA片段得到高度抑制，而特異性c-myc

20、基因的cDNA得到充分富集，提示所構(gòu)建的 cDNA文庫是高度特異的。文庫擴(kuò)增后得到 350個陽性克隆和40個陰性克隆，隨機(jī)挑取 200個陽性克隆酶切分析證實(shí)其中 190個克隆的質(zhì)粒內(nèi)均載有單一片段，平均50400bp，片段插入率95，提示擴(kuò)增的文庫中每一克隆可能均載有高特異性目的片段。人腎癌cDNA消減文庫構(gòu)建的意義在于：(1)大大減少了進(jìn)一步應(yīng)用 Northen Bo1t、 RT-PCR、 DNA測序、 RACE等技術(shù)篩選鑒定克隆腎癌特異基因、基因全長獲得、基因登錄、基因功能研究（正在試驗(yàn)中）的盲目性，提高了特異性，并且有利于克隆出低豐度的稀有基因。(2)消減文庫構(gòu)建在腎癌組織標(biāo)本的基礎(chǔ)上，

21、因此具有重要的臨床意義和應(yīng)用價值。(3)隨機(jī)挑選的15個 cDNA片段測序表明均為未知新基因片段，為研究腎癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理提供重要的條件，為腎癌的預(yù)防、早期特異性診斷、基因治療提供了新的重要工具。本課題受國家自然科學(xué)基金資助(39870841)作者單位：張強(qiáng)(100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所)龔侃(100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所)辛殿旗(100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所)梁麗莉(100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所)那彥群(100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿

22、外科研究所)郭應(yīng)祿(100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所)張志文(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理系)參考文獻(xiàn)1，Diatchenko L,Lau YFC,Campbell AP,et al.Suppression subtractive hybridization:A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl Acad Sci USA,1996,936025-6030.2，Clark JM.Novel non-templ

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