大孔樹脂對(duì)水芹菜總黃酮的分離純化研究

1、大孔樹脂對(duì)水芹菜總黃酮的分離純化研究作者：唐巧玉，周毅峰，任甜甜，江曼【摘要】 目的研究大孔樹脂分離水芹菜總黃酮的條件。方法利用靜態(tài)吸 附方法篩選分離水芹菜總黃酮的最適大孔樹脂，利用動(dòng)態(tài)吸附方法研究最適大 孔樹脂分離水芹菜總黃酮的條件。結(jié)果大孔樹脂AB-8是吸附水芹菜總黃酮的效 果最好，最佳分離條件是：上樣速率是1.5 ml min-1, 5 BV80%的乙醇以1. 0 ral min-1的速率洗脫。結(jié)論利用大孔吸附樹脂AB-8在以上最佳條件下，可使9. 98%水芹菜總黃酮純度提高到25. 8%?！娟P(guān)鍵詞】水芹菜；黃酮；大孔樹脂Abstract ： ObjectiveTo study the

2、condition of separating total flavonoids in bengal waterdropwort herb with macroporousresin. MethodsUsing static absorption, optimum macroporous resin which was used for separating total flavonoids in bengal waterdropwort herb was selected. Using dynamic absorption, the condition of separating total

3、 flavonoids in bengal waterdropwort herb optimum macroporous resin was studied. ResultsOptimum macroporous resin was AB-8, and the optimum codition was as follow:the speed that sample flows through macroporous resin was 1.5 ml min-1, and the total flavonoids absorbed on macroporous resin can eluted

4、by 80% ethanol of 5 BV, the elution speed was 1.0 ml min-1. ConclusionUsing upwards condition, the purity of total flavonoids in bengal waterdropwort herb can be increased to 25. 8% from 9. 98%.Key words： Oenanthe javanica； Flavonoid； Macroporous absorbent水芹菜屬傘形科多年生宿根草本水生植物，別名水芹。水芹為傘形科水芹 屬植物水序Oenant

5、he javanica (0J的全草，又名水英、野斧菜等1。其 營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種人體內(nèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量甚至超過(guò) 旱芹，具有良好的食用價(jià)值2。同時(shí)，水芹在臨床中對(duì)高血壓病、高脂血癥、 心腦血管疾病、乙型肝炎患者具有防治作用3，4，其中水芹所含有的黃酮 類物質(zhì)發(fā)揮了重要作用。但目前的研究主要集中對(duì)水芹菜的栽培技術(shù)、育種、 生產(chǎn)工藝、凈化水體效果等方面，對(duì)于水芹黃酮的報(bào)道甚少5，6。本研究 選水芹菜為材料基于水芹菜中黃酮類物質(zhì)存在藥理方面的作用，采用大孔吸附 樹脂法7, 8對(duì)水芹菜黃酮類化合物進(jìn)行分離純化，篩選出一種較為合適分 離純化水芹菜黃酮的大孔吸附樹脂，提高水芹菜提取物粗

6、黃酮的純度和生產(chǎn)效 率，以期能得到具有高生物活性而無(wú)副作用的高純水芹菜黃酮提取物。 1材料與儀器1.1材料及處理水芹菜采于湖北民族學(xué)院后山。將新鮮水芹菜洗凈，于 6CTC 烘箱中烘干，粉碎，過(guò)孔徑60目篩，裝于棕色試劑瓶備用。1.2藥品大孔吸附樹脂NKA 、NKA-9、X_5、AB-8 (天津南開大學(xué)生產(chǎn)）；蘆 丁標(biāo)準(zhǔn)品(進(jìn)口分裝 ，95%乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，以上試劑均 為分析純。0.3儀器AL204電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），LXJ-IIB 離 心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造 ，RE-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限 責(zé)任公司），可見光分光光度計(jì)(上海棱光技

7、術(shù)有限公司）。2方法2.1樹脂的預(yù)處理9將各種大孔吸附樹脂，分別用95%的乙醇浸泡24 h ，并不時(shí)用玻璃棒攪拌，使樹脂和乙醇充分接觸，以便從孔中趕出空氣。將浸 泡好的樹脂上柱先用95%的乙醇沖洗，直至流出液無(wú)白色為止。然后用2 BV(2 倍的上柱的大孔樹脂的體積 的4%的NaOH 沖洗，并關(guān)閉30 min, 用蒸餾水洗至 中性。再用2 BV的5%HC1沖洗，并關(guān)閉30 min,最后用蒸餾水洗至中性，處 理完畢后用蒸餾水浸泡保存。2.2水芹菜黃酮粗提液的制備稱取一定量的樣品，料液比1:35, 乙醇濃 度80%，在90°C 的水浴鍋中回流提取2.5h, 5 000 r/min離心15

8、min, 取其上 清液。將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，濃縮液5 000 r/min離心15 min, 取其 上清液，即得到黃酮粗提液。2.3水芹菜黃酮測(cè)定方法10水芹菜黃酮含量測(cè)定采用以蘆丁為對(duì)照品 的 NaN02-Al (N03 3-NaOH 顯色比色法。2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附稱取各種濾干濕大孔樹脂1 g，放入相同型號(hào)的燒 杯中，加入黃酮粗提液20 ml,放入電動(dòng)振蕩器上，振蕩吸附24 h，過(guò)濾，吸取 吸附后的溶液0.4 ml測(cè)其吸光度，計(jì)算出樹脂在室溫下的吸附量和吸附率。 取吸附飽和的樹脂，加入80%的乙醇20 ml,浸泡振搖4 h，過(guò)濾，取解吸后的 溶液0.3 ml，測(cè)定濾液中黃酮的濃度

9、，根據(jù)黃酮解吸量計(jì)算解吸率。2.5 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附上柱速率測(cè)定：取處理好的AB-8大孔吸附樹 脂8g ，裝柱約10 cm 高。將6份50 ml 0. 3mg ml-1的黃酮粗提液分別以0. 5， 1.0，1.5，2.0, 2.5, 3. 0 ml min-1的速率進(jìn)行上柱，再用5 BV的水洗柱， 80%乙醇5 BV洗脫，然后測(cè)定其吸附率。乙醇解吸濃度確定：將5份50 ml 0.3 mg ml-1的黃酮粗提液分別以 0.5ml min-1的速率進(jìn)行上柱，再用5 BV的水洗柱，分別用5 BV20%，40%， 60%，80%，95%的乙醇進(jìn)行洗脫，然后測(cè)其解吸率。乙醇洗脫體積確定：將6份5

10、0 ml 0. 3 mg ml-1的黃酮粗提液分別以1. 5 ml min-1的速率進(jìn)行上柱，再用5 BV的水洗柱，分別用80%的乙醇2，4，5， 6，7，8 BV進(jìn)行洗脫，然后測(cè)其解吸率。乙醇洗脫速率測(cè)定：將5份50 ml 0. 3mg ml-1的黃酮粗提液分別以1. 5 ml min-1的速率進(jìn)行上柱，再用5 BV的水洗柱，分別以0. 5，1. 0，1. 5, 2. 0，2.5 ml min-1的速率進(jìn)行洗脫，洗脫劑為80%的乙醇5 BV，然后測(cè)其解吸率。3結(jié)果2. 1吸附量的確定大孔吸附樹脂的性能對(duì)黃酮的純化效果有一定的影響， 是由其物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)所決定，樹脂的孔徑、比表面積及極性等是影

11、響吸附性能 的重要因素，樹脂吸附的本質(zhì)是吸附劑和吸附質(zhì)之間的范德華力，幾種樹脂的 型號(hào)和物理結(jié)構(gòu)參數(shù)見表1。表1 4種大孔樹脂的物理性質(zhì)以“2.4”項(xiàng)的方法對(duì)X-5, AB-8，NKA-9, NKA 4種大孔吸附樹脂對(duì)水芹菜 黃酮水溶液的吸附量做測(cè)定。從表2可看出，AB-8大孔吸附樹脂對(duì)水芹菜黃酮 水溶液的吸附量最大，X-5次之。說(shuō)明對(duì)水芹菜總黃酮的樹脂柱的吸附應(yīng)優(yōu)先 選用弱極性的樹脂。從表3可看出，AB-8大孔吸附樹脂對(duì)水芹菜黃酮水溶液的 解吸率最大，NKA 次之。綜合考慮各樹脂的吸附和解吸性能，選用AB-8大孔吸 附樹脂來(lái)分離純化水芹菜黃酮粗提物。表2 4種大孔樹脂吸附性能的比較，表 3

12、4種大孔樹脂解吸性能的比較（略）3.2上樣速率的選擇上樣速率一般都要求較慢，這是因?yàn)榱魉龠^(guò)快，吸附 效果差，吸附不完全。但是流速過(guò)慢，會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，增加成本。因此有必 要選擇一個(gè)合適的上樣速率使之既能達(dá)到一定的吸附率又能盡可能的節(jié)約時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)按“2.5”項(xiàng)的方法測(cè)定了上樣速率對(duì)吸附效果的影響，（見表4 。吸附 率隨上樣速率的增快而降低，黃酮吸附率和上樣流速呈極顯著線性負(fù)相關(guān)，線 性回歸方程為：Y=-4. 314 8X+83. 809 3 (Y：吸附率，X ：上樣流速ml min- 1 。但是在綜合考慮吸附率和應(yīng)用于生產(chǎn)中的周期長(zhǎng)短，選取1. 5ml min-1 的上樣流速。表4上樣流速對(duì)吸

13、附效果的影響（略）2. 3解吸液濃度的選擇為了研究AB-8大孔吸附樹脂解吸水芹菜黃酮的最 佳乙醇洗脫濃度，實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定AB-8大孔吸附樹脂解吸前后黃酮含量來(lái)確定不 同乙醇洗脫濃度的解吸率，結(jié)果見表5。當(dāng)乙醇濃度小于80%時(shí)，乙醇濃度和解 吸率呈極顯著的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.927 842 (大于0.75 , 線性方程 Y=0. 823 3X+3. 398 9 (Y：乙醇濃度，X ：解吸率 。當(dāng)乙醇解吸濃度大于80%時(shí)，其解吸效果呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此實(shí)驗(yàn)所采用的乙醇解吸的濃度梯度中，以 乙醇解吸濃度為80%的解吸效果最佳。表5乙醇濃度對(duì)解吸效果的影響（略）3.4乙醇洗脫體積的選擇在確定了乙醇的

14、最佳濃度之后，進(jìn)一步對(duì)洗脫液 的最佳用量進(jìn)行了確定，其原則是在充分洗脫所吸附黃酮的前提下，盡量節(jié)省 洗脫劑的用量。從表6可以看出，當(dāng)乙醇的洗脫用量達(dá)到5 BV時(shí)，解吸率為 73.22.%，超過(guò)5BV 時(shí)，解吸率基本不再增加。因此，本實(shí)驗(yàn)所采用的乙醇洗 脫體積為5 BV。表6洗脫體積對(duì)解吸效果的影響（略）0. 5洗脫速率的選擇為了研究AB-8大孔吸附樹脂吸附水芹菜黃酮的最佳洗脫速率，實(shí)驗(yàn)通過(guò)“2.5”項(xiàng)的方法測(cè)定AB-8大孔吸附樹脂洗脫前后黃酮含 量來(lái)確定不同洗脫速率的解吸率，結(jié)果見表7。從表7可看出當(dāng)洗脫速率大于 1.0 ml min-1時(shí)，解吸速率和吸附率呈極顯著的線性負(fù)相關(guān)，r=_0. 9

15、903, 線 性方程：Y=-7. 6X+85. 08 (Y：解吸速率ml min-1，X ：吸附率（ 。當(dāng)洗脫速 率小子1.0 ml min-1時(shí)，解吸效果呈下降趨勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)所采用的乙醇洗 脫速率梯度中，以洗脫速率1. 0 ml min-1解吸效果最佳。表7 洗脫速率對(duì) 解吸效果的影響（略）3.6樹脂的富集能力配制黃酮濃度為0.3 mg ml-1的黃酮水溶液50 ml, 以1. 5 ml min-1的速率進(jìn)行上柱，再用5 BV的水洗柱，以1. 0 ml min-1的速率進(jìn)行洗脫，洗脫劑為80%的乙醇50 mlo收集流出液、水洗液及解吸液，測(cè) 得解吸液黃酮濃度為0. 212 mg ml-1。

16、分別取20 ml上柱前黃酮濃度為0. 3 mg ral-1的黃酮水溶液和上柱后的解吸液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，烘干，冷卻。 測(cè)得純化前黃酮純度為9. 98%,純化后純度為25. 8%，黃酮回收率為70. 53%。4討論本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)4種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂NKA 、NKA-9、X_5、AB-8對(duì)水 芹菜黃酮粗提物的靜態(tài)吸附和解吸性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)AB-8大孔吸附樹脂在 幾種常用的用于富集黃酮的大孔樹脂中吸附與解吸能力最好，并通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附 實(shí)驗(yàn)對(duì)上樣速率、解吸液濃度、解吸液體積及洗脫速率進(jìn)行了研究，確定該樹 脂的最佳條件為：以1. 5 ml min-1的流速上樣后，然后用5BV80%的乙醇以 1.0 ml min-1的速率洗脫。經(jīng)樹脂富集后黃酮的純度為25. 8%,比純化前的純度提高了 1.59倍。【參考文獻(xiàn)】1袁春景，徐興安. 營(yíng)養(yǎng)保健水芹菜J.農(nóng)民科技培訓(xùn)，2007，11： 35.2 劉恒蔚，高夢(mèng)祥，饒貴珍. 野生水芹與旱芹的營(yíng)養(yǎng)成分比較分析J.中國(guó)野生植物資源，2007，26 (1: 36.3 王鵬，劉惠民. 中藥水芹降血脂的實(shí)驗(yàn)研究J.河北中醫(yī)，1994， 17(1 ： 38.4 宋丹，趙穎. 治療乙型肝炎的中草藥研究進(jìn)展J.重慶中草藥研 究，2006,1: 41.5 毛飛，顧蘇俊，楊坤. 水芹總黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)研究J.中 國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2007，4(4: 4