凋亡相關基因-Bax在不同細胞中表達產物差異檢測

1、凋亡相關基因Bax在不同細胞中表達產物差異檢測江一舟 06級臨八1班 063010101931 實驗目的1.1 通過測定凋亡相關基因Bax在不同細胞中表達產物差異檢測，研究缺糖對細胞增殖抑制作用的機制（引起細胞凋亡或壞死）。1.2 掌握免疫組織化學法的原理。2 實驗原理2.1 免疫細胞化學和親和組織化學免疫細胞化學（免疫組化）將抗原、抗體間的免疫反應引入細胞標本，并通過對其所帶有的特殊標記物的顯示，從而對細胞內某抗原或抗體作定性、定位以及定量檢測。 親和組織化學則將一些具有雙價或多價結合力的物質(生物素)，應用于免疫組化，使得抗原抗體的親和力比免疫組化高出100萬倍。其更具高靈敏性和高特異性。

2、2.2 凋亡相關基因BaxBax是Bcl-2家族成員。凋亡信號能激活Bax，使Bax蛋白從胞漿移位到線粒體膜上。隨后其蛋白構象發(fā)生改變（寡聚化），使線粒體膜通透性增加，釋放Cytc，引起細胞凋亡。3.3 Bax表達產物差異檢測本次實驗以Bax構象蛋白為抗原，用小鼠特異性抗體（一抗）與其結合，再用生物素標記的羊抗小鼠抗體（二抗）與前者結合，形成了生物素復合物。此復合物與SABC作用，使得檢測物被放大，最后在顯色劑DAB的作用下，Bax構象蛋白顯色（褐色）。3 實驗材料儀器：移液槍、槍頭、滴管、顯微鏡。材料：培養(yǎng)細胞。試劑：甲醇、PBS、封閉液、一抗、二抗、SABC、DAB、0.3H2O2-PBS

3、。4 實驗步驟培養(yǎng)細胞（96孔板，每組3正常、3損傷、3損傷恢復） PBS洗，5min X 3次 (輕輕地洗滌) 甲醇固定10min PBS洗，5min X 3次 加入封閉液（1:10） 25µl，37，30min 加一抗（1:300）25µl，37，1h PBS洗，5min X 3次 加二抗25µl，37，1h PBS洗，5min X 3次 加0.3 H2O2-PBS，37，30min PBS洗，5min X 3次 SABC工作液20-30µl，37，1h PBS洗，5min X 3次 DAB顯色，觀察結果。5 實驗結果正常組的細胞形態(tài)飽滿，胞質透明，

4、基本不著色，核形態(tài)規(guī)則，為圓形或橢圓形。損傷組中，部分細胞呈現(xiàn)典型凋亡細胞形態(tài)，細胞變圓、皺縮，胞質深染，核質比例增大；其余細胞胞質著色較正常組深。損傷恢復組中，少部分細胞呈現(xiàn)典型凋亡細胞形態(tài)，細胞變圓、皺縮，胞質深染，核質比例增大；其余細胞胞質著色較正常組深。免疫組化顯示，Bax構象蛋白在正常組細胞中幾乎沒有表達，而在損傷組和損傷恢復組中均有表達，其中損傷恢復組的Bax構象蛋白表達量高于損傷組（圖1）。CBA圖1 免疫細胞化學法檢測Bax蛋白的表達A：正常組的CHL細胞；B：損傷組的CHL細胞；C：損傷恢復組的CHL細胞6 討論6.1 Bax可以被凋亡信號激活，從胞漿移位到線粒體膜上，隨后其

5、蛋白構象發(fā)生改變（寡聚化），使線粒體膜通透性增加，釋放Cytc，引起細胞凋亡。Bax促進凋亡的機理主要是：線粒體滲透性轉換、氧化磷酸化和ATP的合成功能被破壞；細胞氧化還原作用改變；線粒體中的凋亡相關Apaf-1 釋放出來，與細胞色素c相互作用，激活Caspase信號轉導途徑。Bax構象蛋白含量可以作為評價細胞凋亡的指標。本實驗用免疫組化法檢測了正常組、損傷組、損傷恢復組的Bax構象蛋白表達變化，結果顯示，Bax構象蛋白陽性表達量：損傷組>損傷恢復組>正常組。由此可知，缺糖對CHL細胞增殖的抑制作用是通過促進細胞凋亡實現(xiàn)的；細胞凋亡程度：損傷組>損傷恢復組>正常組。6.

6、2 本實驗中，損傷組細胞的Bax構象蛋白表達量高于損傷恢復組，原因可能是損傷時間（5h）不長，線粒體和細胞膜的正常功能未完全喪失，糖的重新加入一方面為細胞提供了能量來源，另一方面可以增強細胞質和線粒體內的應激蛋白（如grp75）的表達，而grp75的上調表達可以起到保護蛋白質，協(xié)助蛋白（特別是線粒體蛋白）轉運，提高細胞對應激反應耐受性的作用，從而延緩細胞凋亡。當缺糖時間過長時，由于線粒體和細胞膜的正常功能已基本喪失，糖的重新加入可能不會延緩細胞的凋亡進程，甚至可能通過引起ROS的升高，造成缺糖恢復組的凋亡程度高于缺糖組（可以設計實驗進行探索）。6.3 正常組中，細胞密度較高區(qū)域的細胞呈現(xiàn)Bax

7、構象蛋白高表達，原因可能是接種細胞過多以致部分區(qū)域細胞發(fā)生凋亡。6.4 幾種試劑的作用6.4.1 封閉液可以封閉非特異性位點，從而保證抗原抗體間的特異性結合。6.4.2 0.3 H2O2-PBS（甲醇）可以消除內源性過氧化物酶活性作用，從而消除其對SABC-DAB顯色的影響。6.4.3 SABC 是鏈酶親和素生物素過氧化物酶復合，起到信號放大作用。6.5 檢測細胞凋亡的其他方法凋亡相關蛋白（Bax, Bcl-2, Caspase-3、8、9等）表達變化的檢測除了用免疫組化法外，還可以用Western blot法。除此以外，還可以利用透射電鏡、熒光顯微鏡、DNA ladder、流式細胞儀檢測細胞

8、凋亡 。6.6 后續(xù)實驗設計本實驗檢測到了Bax構象蛋白在損傷組和損傷恢復組細胞中的表達，可以設計后續(xù)實驗，研究缺糖誘導細胞凋亡的信號通路。核轉錄因子B（nuclear factor-B，NF-B）是普遍存在于細胞漿中的一種快反應轉錄因子，是由p50和p65（Rel-A）兩個亞單位構成的異源二聚體，p50 是與DNA 結合的部分，p65 是與抑制蛋白IB（Inhibitors of Kappa B）結合的部分。眾多研究結果指出，核轉錄因子NF-B在抑制細胞凋亡中起到重要作用。NF-B有多種功能，其一就是增強Bcl-2 表達和抑制Bax表達。Bax/Bcl-2 比值的升高可以激活Caspase-3，而Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行者，它可直接降解胞內的結構蛋白和功能蛋白，引起凋亡。缺糖誘