雙氨基聚乙二醇的制備及分離純化

1、中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6 · ·423藥物制劑聚乙二醇(PEG 是由乙醇單體聚合而成的線形 高分子,結(jié)構(gòu)式為 H (OCH 2CH 2 n OH 。目前廣泛用 來修飾多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、納米粒等藥物和載 體 1-6。 PEG 的末端羥基須在較激烈的條件才能與 其它基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),因此必須通過適當(dāng)方式活化。 可根據(jù)不同需要,用醛基、氨基、異氰酸酯基、羧 基和烯基等基團(tuán)取代該羥基 7,8。傳統(tǒng)活化方法包 括氰脲酰氯法和羥基琥珀酰亞胺法。其中胺化方法 包括甲苯磺酸酯法、疊氮化物還原法及 Mitsu

2、nobu-雙氨基聚乙二醇的制備及分離純化劉 敏,徐 雯,朱葉歡,潘 弘,陸偉躍 *(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室,上海 200032摘要 :聚乙二醇 2000經(jīng)氯代、疊氮化、氫化還原 3步反應(yīng)制得雙氨基聚乙二醇(1粗品,總收率 57%。采用陽離子交換樹 脂,以不同濃度的乙酸鹽緩沖液(pH 5.7梯度洗脫,得到的 1純品采用 IR 、 1HNMR 和 HPLC 等方法進(jìn)行檢測,并用高效分 子排阻色譜法測定相對分子量。關(guān)鍵詞 :雙氨基聚乙二醇;制備;純化;檢測中圖分類號 :TQ314.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 :A 文章編號 :1001-8255(2007 06-0423-04收稿日期 :2006-07-31基

3、金項(xiàng)目 :國家自然科學(xué)基金(30672545和上海市納米科技專項(xiàng)基 金(0652nm011作者簡介 :劉 敏(1969,女,碩士,講師,從事高分子藥物載體 和脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)研究。E-mail :liumin通訊聯(lián)系人 :陸偉躍(1960,男,教授,博士生導(dǎo)師,從事藥物靶 向傳釋系統(tǒng)研究。Tel Fax E-mail :wyluPreparation and Puri cation of Amino-terminated Poly(ethylene glycolLIU Min, XU Wen, ZHU Ye-huan, PAN Hong,

4、 LU Wei-yue*(Dept. of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032ABSTRACT: The amino-terminated poly(ethylene glycol(1 was obtained from polyethylene glycol 2000 bychlorination, azidation and catalytic hydrogenation with an overall yield of 57%. The title compound was puri e

5、d using cation exchange resin with gradient eluent of acetate buffer solution (pH 5.7 of different concentrations. The structure of pure product was characterized by IR, 1HNMR and HPLC. The relative molecular weight of 1 was determined by size-exclusion chromatography.Key Words: amino-terminated pol

6、y(ethylene glycol ; preparation; puri cation; characterizationStaudinger 法等 9-11。由于疊氮化物還原法具有成本 低、反應(yīng)條件溫和、胺化產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn),本研究 采用該法以 PEG 2000為原料,經(jīng)氯代、疊氮化、 氫化還原 3步制備了雙氨基 PEG (1,總收率 57%。 再利用陽離子交換樹脂分離純化,最后通過 IR 、1HNMR 和 HPLC 進(jìn)行檢測,并測定相對分子量。1 儀器與試藥Äk t a e x p l o r e r 型中壓層析系統(tǒng)(瑞典安發(fā)瑪西亞公 司 ; 1100型 高 效 液 相 色 譜 儀

7、 (美 國 安 捷 倫 公 司 ; AVATA R T M 360型傅里葉變換紅外光譜儀(美國 T h e r m o Nicolet 公司; Mercury Plus 400MHz型超導(dǎo)核磁共振波譜儀 (美國 Varian 公司。P E G 2000(化學(xué)純,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑 公司; PEG 對照品(相對分子質(zhì)量 1000、 2000、 3350、 6000、 10000和 20000,美國 Sigma 公司;單氨基聚乙二醇 2000和 1對照品(美國 Shearwater Polymer公司。· · 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pha

8、rmaceuticals 2007, 38(6 4242 方法與結(jié)果2.1 1的制備2.1.1 試劑的預(yù)處理氯化亞砜:氯化亞砜 200ml 中加喹啉 60ml ,混勻,放置過夜。過濾,濾液蒸餾,收集約 72的餾分。所得餾分重蒸餾,收集 7678的餾分,避光密閉保存。乙醇:取鎂條 2.5g 和碘 0.5g 置無水乙醇 50ml中, 80回流 30min 。補(bǔ)加無水乙醇 600ml ,回流30min 后蒸餾,收集 78的餾分,避光密閉保存。甲苯、二氯甲烷、 DMF 和吡啶等試劑均經(jīng)無水處理。2.1.2 雙氯代聚乙二醇(2取 PEG 2000 80g(0.04mol 溶于甲苯 350ml 中,再加入

9、吡啶 8ml 和氯化亞砜 23ml , 120回流 2h 。反應(yīng)液冷至室溫,過濾,濾液減壓蒸除甲苯,冷至室溫。所得黏稠液體中加入二氯甲烷 300ml 和 Al 2 O 3200g (2mol ,攪拌 2h ,過濾。濾液減壓蒸去二氯 甲烷。剩余物滴至冷無水乙醚 2.5L 中,析出白色 沉淀,抽濾,濾餅減壓干燥,得白色粉末狀固體 2 (60g ,以 PEG 2000計,收率為 75%。 Rf0.59展開 劑:氯仿 -二氯甲烷 -甲醇 -正丁醇(5 3 3 0.1, 碘蒸氣顯色。2.1.3 雙疊氮聚乙二醇(3如上所得 2(60g , 0.029mol 溶于 DMF 400ml中,加入疊氮化鈉 35g

10、 (0.54mol , 115回流 2h , 冷至室溫,過濾。濾液減壓蒸除 D M F ,冷至室 溫,用二氯甲烷 300ml 溶解,過濾,濾液濃縮后滴 至冷無水乙醚 3L 中沉淀,抽濾,濾餅減壓干燥,得白色固體 3(52g ,以 2計,收率 87%。 Rf0.71展開 劑:氯仿 -甲醇 -丙酮 -正丁醇(8.2 1 1 1.6,碘 蒸氣顯色。2.1.4雙氨基聚乙二醇(1將如上所得 3(52g , 0.025mol 溶于無水乙醇 -二 氯甲烷(6 1混合溶劑 300ml 中,加 10%鈀炭 3g , 室溫 5atm 氫化 24h 。反應(yīng)液經(jīng) 0.22m 微孔濾膜抽 濾,濾液濃縮后滴至冷無水乙醚

11、3L 中沉淀,抽濾, 濾餅減壓干燥,得白色 1粗品(46g ,以 3計,收率 88%。2.2 1的分離純化先前的研究中,本試驗(yàn)室已建立了檢測 1純度 的 HPLC 法 12。利用 TSK-GELG4000 PWXL凝膠滲 透色譜柱上存在的少量荷負(fù)電的基團(tuán)與酸性條件 下荷正電 PEG 的氨基之間的離子交換作用,用低 離子強(qiáng)度的流動相洗脫,無氨基取代的 PEG 2000首先被洗脫,單氨基聚乙二醇次之, 1再次之。色譜條件如下:色譜柱 TSK-GEL G4000 PW XL 柱 (7.8mm×300mm, 10m ,示差折光檢測器, 流動相 5mmol/L氯化鈉溶液(pH 4.0, 流速

12、0.5ml/min, 柱溫 25, 進(jìn)樣量 20l 。色譜圖見圖 1。購得的 PEG 2000、單氨基聚乙二醇和 1保留時間分別為 21.2、 23.6和 30.6min ,測得自制的 1粗品主峰保留 時間基本與購得品相同。照峰面積積分法計算,粗 品中 1的含量為 78%。采用 UNOsphere TM Q 強(qiáng)陽離子交換柱(美國 Bio-Rad , 25mm×120mm, 100m ,用 10mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH 5.7平衡色譜柱。取 1粗品 3g , 以注射用水 10m l 溶解,上柱。梯度洗脫洗脫液 A :10mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH 5.7,洗脫液 B : 60

13、mmol/L乙酸鹽緩沖液(pH 5.7, 100min 內(nèi)洗脫 液從 100% A轉(zhuǎn)為 100%B ,流速 3ml/min。用上述 HPLC 法檢測洗脫液。合并含單氨基聚乙二醇組分 A :購得品, B :自制粗品1-1; 2-單氨基聚乙二醇 2000; 3-PEG 2000圖 1 HPLC圖譜10203040400080001200020004000600010203040At /minB123123中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6 · ·425的洗脫液,用氫氧化鈉溶液調(diào)至 pH 9.0,凍干。取

14、凍干品 2g 上 Sephadex G-15柱,以注射用水為洗脫 液脫鹽,收集洗脫液凍干,得 1純品1.5g ,精制率 50%,純度>95%(HPLC 法,色譜圖見圖 2。 2.3 結(jié)構(gòu)表征與相對分子量測定 2.3.1 紅外光譜和 1HNMR紅外光譜:K B r 壓片,結(jié)果見圖 3。與 P E G 2000的紅外光譜比較, 1純品圖譜中 3400cm -1附近 出現(xiàn)一個弱的寬吸收帶,其強(qiáng)度遠(yuǎn)低于 o-H (中等強(qiáng) 度,可能為 N-H 特征峰;兩者均在 2887cm -1出現(xiàn)一 個很強(qiáng)的尖吸收帶,即亞甲基的 c-H 特征峰;另外 亞甲基對應(yīng)的剪式振動吸收帶位于 1467cm -1處,中等強(qiáng)

15、度; 1114cm -1處出現(xiàn)強(qiáng)的尖吸收帶為 c-o-c 特征 峰。1-1圖 2 1純品的色譜圖4008001200160010203040t /min110.08.06.04.02.04000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500A13121110987654324000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500B圖 3 PEG 2000(A 和 1(B 的紅外圖譜1HNMR :溶劑為重水,樣品濃度為 10mg/ml, 結(jié)果見圖 4。 1純品,-NH 2:2.9(2H ,三重峰,圖 4 PEG 2000(A 和 1(B 的 1HNMR

16、圖譜8 7 6 5 4 3 2 18 7 6 5 4 3 2 1AB-CH 2-CH 2-O -(PEG 分子中:3.33.8(多重 峰。2.3.2 高效分子排阻色譜法測定 1相對分子量照中國藥典 2005年版附錄 H 和右旋糖酐 20 (P88的分子量與分子量分布項(xiàng)下方法測定 1相對分子量。色譜條件如下:色譜柱 TSK GEL G2000 SW XL ,示差折光檢測器, 流動相 0.7%硫酸鈉溶液 (含 0.02%疊氮化鈉, 柱溫 35, 流速 0.5ml/min,· · 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007,

17、38(6 426進(jìn)樣量 20l 。 1純品加流動相制成濃度為 10mg/ml的溶液,作為供試品溶液。另取 5個已知分子量的 PEG 對照品,同法制成 10mg/ml的溶液作為對照品 溶液。分別進(jìn)樣測定,采用 GPC 軟件(美國 Agilent 公司, A.02.01版本將保留時間對對照品分子量線 性回歸,由所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品的相對分子 量。結(jié)果表明, 1的重均分子量為 2045,分子量分 散程度為 1.0915。3 討論3.1 1的制備本實(shí)驗(yàn)制備 1的總收率為 57%,粗品純度為 78%。在制備過程中應(yīng)該注意以下幾點(diǎn):首先,氯 代反應(yīng)時加入氯化亞砜后會產(chǎn)生大量沉淀,這些沉 淀經(jīng) TLC

18、檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)同樣含有 2,因此,用二氯甲 烷盡可能地將沉淀中的 2溶解出來與產(chǎn)品合并一起 進(jìn)行處理以提高產(chǎn)率;其次,由于生成的 2中可能 含有雜質(zhì)硫,而硫的存在將導(dǎo)致后續(xù)氫化還原步驟 中的鈀炭催化劑中毒,因此在產(chǎn)品中加入活化的氧 化鋁以吸附硫及其它雜質(zhì)。最后, 3步反應(yīng)都是采 用無水乙醚沉淀法得到產(chǎn)品,無水乙醚的用量應(yīng)至 少為濃縮液的 810倍,且冷的無水乙醚沉淀效果 更好。3.2 1的分離純化1粗品中的主要雜質(zhì)為單氨基聚乙二醇、無氨 基取代的 PEG 2000和少量小分子物質(zhì)等。陽離子 交換樹脂是以陰離子交換劑為固定相,借助于樣品 中電離組分對其親和力的不同從而達(dá)到分離離子型 或可離子化的化合

19、物的目的。一般在陽離子交換樹 脂骨架上引入的酸性基團(tuán)有磺酸基、羧基和酚羥 基等。在 1純化過程中,首先將 1酸化成 NH3+-PEG2000-NH3+,根據(jù)胺基數(shù)目的不同, PEG 2000、單 氨基聚乙二醇、 1在陽離子交換樹脂上的吸附性也 依次增強(qiáng)。用乙酸鹽緩沖液梯度洗脫可達(dá)到分離純 化的目的。3.3 結(jié)構(gòu)分析IR 圖譜中,理論上-NH2在 3500和 3400cm -1附近有兩條弱的吸收帶,但由于-NH2在 1中所占 比例少,不易顯現(xiàn)。與 PEG 2000圖譜比較,該處 吸收帶的強(qiáng)度顯著低于-OH 的吸收。另外, PEG 的各種特征峰都存在,包括 C -H 的伸縮振動峰、 -C H2-的

20、剪式振動峰和 C -O -C 的伸縮振動峰 等。 1HNMR 圖譜中,與 PEG 2000圖譜比較,在 2.90處增加了一個三重峰,推斷是與-CH 2連接的-NH2的化學(xué)位移,且含與重復(fù)結(jié)構(gòu)-CH2CH 2O 相 同的化學(xué)位移。 HPLC 檢測結(jié)果顯示自制 1具有與購 得品相同的保留時間,結(jié)合分子量等數(shù)據(jù),可確證 結(jié)構(gòu)。參考文獻(xiàn):蔣為民 , 王 妍 . 蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇修飾J . 微生物學(xué) 免疫學(xué)進(jìn)展 , 2005, 33(4 : 72-75.趙 蓉 , 朱家壁 . 聚乙二醇修飾的立體穩(wěn)定脂質(zhì)體J . 國外 醫(yī)學(xué) : 藥學(xué)分冊 , 1999, 26(3 : 161-166.卞麗紅 , 梅興

21、國 , 章?lián)P培 . 新一代 PEG 在修飾抗原和藥物緩 釋中的應(yīng)用J . 生命科學(xué) , 2004, 16(5 : 296-300.趙樹進(jìn) , 尹 亮 , 郭 勇 , 等 . 聚乙二醇修飾后超氧化物岐化 酶的穩(wěn)定性及其在家兔體內(nèi)過程J . 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志 , 2003, 23(4 : 193-196.張宇鋒 , 謝蜀生 , 侯新樸 , 等 . 具有活性羧基末端的長循 環(huán)脂質(zhì)體的制備和分布J . 藥學(xué)學(xué)報 , 2000, 35(11 : 854-859.付春曉 . 蛋白的聚乙二醇修飾及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 J . 國外醫(yī)學(xué) : 藥學(xué)分冊 , 2001, 28(2 : 78-81.董炎明 . 高分子材料實(shí)用剖析技術(shù)M . 北京 : 中國石化出 版社 , 1997: 80-81.王琴梅 , 潘仕榮 , 張靜夏 . 雙端氨基聚乙二醇的制備及表征 J . 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 , 2003, 34(10 : 490-4