硫酸軟骨素總述

1、.硫酸軟骨素一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介 :硫酸軟骨素是來(lái)自動(dòng)物軟骨組織的一類(lèi)天然的酸性粘多糖（因其具有粘稠性） 糖胺聚糖 （其中糖胺聚糖作為動(dòng)物蛋白聚糖的代表成分，在軟骨組織中以蛋白多糖形式存在），不同動(dòng)物體內(nèi)所存在的硫酸軟骨素類(lèi)型不同，主要是CAS、CSC 及各種硫酸軟骨素的混合物，其中豬牛羊的骨中主要含有硫酸軟骨素A，鯊魚(yú)烏賊等海洋動(dòng)物的軟骨中主要含有硫酸軟骨素C。區(qū)別：蛋白多糖以蛋白為核心，糖蛋白以多糖為主體；或者說(shuō)側(cè)重點(diǎn)不同，雖然組成成分是一樣的，但是糖蛋白定義為蛋白，蛋白聚糖定義為糖。糖胺聚糖： 1）蛋白聚糖由三部分組成 -核心蛋白、糖胺聚糖、連接區(qū)寡糖； 2）糖胺聚糖除了通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白聚糖的核

2、心蛋白連接(糖肽鍵）外，糖胺聚糖還通過(guò)靜電作用或立體化學(xué)效應(yīng)與其他蛋白質(zhì)發(fā)生專(zhuān)一性程度不同的結(jié)合。 而蛋白多糖的聚集體則通過(guò)次級(jí)鍵（氫鍵和鹽鍵） 形成，可見(jiàn)從軟骨組織中提取硫酸軟骨素僅依靠破壞次級(jí)鍵的方法是不夠的， 而必須以降解蛋白質(zhì)的方法， 破壞多糖鏈與蛋白的共價(jià)結(jié)合方能達(dá)到提取硫酸軟骨素的目的； 3）因?yàn)樘前肪厶蔷哂姓吵硇裕缘鞍拙厶且脖环Q(chēng)為粘蛋白。 軟骨中粘蛋白等中的糖胺聚糖多由兩種氨基己糖 （氨基葡萄糖和氨基半乳糖） 之一和兩種己糖醛酸（葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸） 之一以各種糖苷鍵連接而成； 4）除透明質(zhì)酸（屬于非蛋白多糖提取）外，糖胺聚糖分子中的氨基己糖.上均含有硫酸基，該硫酸基與己

3、糖醛酸上的羧酸都會(huì)導(dǎo)致整個(gè)蛋白聚糖分子顯酸性，所以糖胺聚糖又被稱(chēng)為酸性粘多糖。二、理化性質(zhì) :1、物理性質(zhì)：硫酸軟骨素，簡(jiǎn)稱(chēng)CS，分子式：（C14H21NO14S)n，成品外觀白色粉末狀，無(wú)臭無(wú)味，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮、冰醋酸等有機(jī)溶劑，遇水后迅速膨脹，對(duì)熱不穩(wěn)定，需避光密封保存。其分子中含有大量的硫酸基和羧基，故呈酸性反應(yīng)， 可與鈉鉀鈣離子結(jié)合成鹽，其鹽類(lèi)對(duì)熱穩(wěn)定。在高溫、堿性、酸性環(huán)境溶液中易水解成單糖或小分子量多糖，因而溶液粘度下降。（游離的硫酸軟骨素水溶液遇較高溫不穩(wěn)定， 主要是乙?；凰?， 從其結(jié)構(gòu)上脫落下來(lái)。）2、化學(xué)性質(zhì)：硫酸軟骨素是來(lái)自動(dòng)物軟骨組織的一類(lèi)天然的酸性粘多糖

4、糖胺聚糖。硫酸軟骨素是氨基己糖和葡萄糖醛酸交替連接而成的直鏈分子，作為動(dòng)物糖胺聚糖中的代表物質(zhì)，硫酸軟骨素由D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰 -D-氨基半乳糖（結(jié)構(gòu)圖如下所示）以1,3 糖苷鍵連接形成雙糖，雙糖單位之間以1,4 糖苷鍵連接。一般硫酸軟骨素約含有50-70 個(gè)雙糖單位，動(dòng)物組織中的硫酸軟骨素平均分子量約為260000。在分子結(jié)構(gòu)上硫酸軟骨素氨基己糖環(huán)的4 位或 6 位可硫酸化。.圖1圖2圖 7圖 5注：乙酰不是一種物質(zhì)，它是一種基團(tuán)，或者說(shuō)是官能團(tuán)，是乙酸去掉羥基后剩下的部分，寫(xiě)為 -COCH3 。硫酸軟骨素常見(jiàn)化學(xué)反應(yīng)有降解反應(yīng)， 硫酸軟骨素不僅在高溫強(qiáng)酸條件下易發(fā)生降解反應(yīng)， 使其

5、分子量降低， 同時(shí)在硫酸軟骨素裂解酶等的作用下也可發(fā)生降解。 其中硫酸軟骨素可被濃硫酸降解成小分子組分，并被硫酸化， 降解的程度和硫酸化的程度隨著溫度的升高而增加，在 30 -50溫度下， 2h 可使平均分子量降至 3000-4000；也可在稀鹽酸溶液中水解而成為小分子產(chǎn)物，溫度越高水解速率越快。硫酸軟骨素是一種聚陰離子的高分子化合物，多數(shù)含有 -SO3H 和.-COOH 等基團(tuán)，易與Na、 K 、 Ca2、 Mg2等陽(yáng)離子結(jié)合，故其都是以金屬鹽成分制成藥品。根據(jù)糖胺聚糖雙糖中單糖分子類(lèi)型、羧基和硫酸基位置的不同，可將其分為透明質(zhì)酸、 硫酸軟骨素 A、硫酸軟骨素 C 等幾類(lèi)。其中透明質(zhì)酸又稱(chēng)玻

6、璃酸，組成單糖為 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖；硫酸軟骨素 A 組成單糖為 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰 -D-半乳糖 -4-硫酸；硫酸軟骨素 C 組成單糖為 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰 -D-半乳糖 -6-硫酸；由此可見(jiàn)透明質(zhì)酸為糖胺聚糖中唯一的非硫酸化多糖， 其他糖胺聚糖的硫酸化位置和數(shù)量與其生理功能密切相關(guān)。三、分離提純?cè)砑胺椒ê?jiǎn)介:1、制備原理硫酸軟骨素屬于酸性粘多糖， 目前酸性粘多糖的提取方法主要有降解法和非降解法。非降解法僅用于非蛋白多糖的粘多糖 -透明質(zhì)酸。降解法適用于包括透明質(zhì)酸在內(nèi)的所有酸性粘多糖， 其主要包括堿鹽法、堿提取法、酶提取法、超聲波法等。1）堿提取法：是基

7、于硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)結(jié)合的 O-糖苷鍵可在堿作用下發(fā)生消去反應(yīng)， 使糖肽鍵斷裂， 硫酸軟骨素從蛋白多糖中釋放出來(lái)， 但在強(qiáng)堿作用下硫酸軟骨素也易發(fā)生降解。2）鹽法提?。夯谝欢x子強(qiáng)度下軟骨中的某些蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)分離的目的。3）堿鹽法：利用堿性條件下，連接硫酸軟骨素和蛋白質(zhì)的糖肽鍵發(fā)生斷裂，使硫酸軟骨素以游離態(tài)釋放，并且通過(guò)控制一定的離子.強(qiáng)度，使軟骨中的某些蛋白質(zhì)沉淀析出，便于濾除。一定范圍內(nèi)，提取物中硫酸軟骨素的含量和得率是隨著堿液濃度的增加而提高。4）超聲輔助法：是利用超聲波的空化作用，使物料周?chē)纬煽昭?，從而有利于硫酸軟骨素提取的方法?原理是在堿性條件下

8、蛋白質(zhì)易離解和超聲波的熱學(xué)機(jī)制可促進(jìn)蛋白質(zhì)快速解離而達(dá)到去雜蛋白質(zhì)的目的，升溫（ 85-90）均可使解離的蛋白質(zhì)變性吸附到白陶土上，從而使硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)分離， 提高產(chǎn)品質(zhì)量。 采用超聲輔助的堿提酶解法提取硫酸軟骨素， 其提取物中硫酸軟骨素的含量和得率并無(wú)明顯提高，但可大大縮短提取時(shí)間。5）酶法： 軟骨中的膠原蛋白和粘蛋白等在中性或弱酸性條件下是可溶的，不易被分離除去。 酶法是利用不同蛋白酶水解蛋白質(zhì)的特異性，使蛋白質(zhì)水解成氨基酸， 再利用硫酸軟骨素與氨基酸的溶解性不同將其提取出來(lái)的方法。 酶法條件溫和， 不易引起硫酸軟骨素的降解，常用的酶制劑有胰酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋

9、白酶等。提取物含氮量越低，表明提取物中的雜質(zhì)蛋白含量越少。2、純化方法溶劑法：是利用軟骨中不同化學(xué)成分的溶解性差異， 而將硫酸軟骨素與其它雜質(zhì)相互分離的純化方法。 硫酸軟骨素含有的硫酸基、 羧基和羥基等親水性基團(tuán)，使其易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙醇和丙酮等有機(jī)溶劑。超濾膜法：是利用濾膜孔徑的不同使硫酸軟骨素與其它非多糖類(lèi)雜質(zhì)分離，而得到分子量范圍較窄且純度較高的硫酸軟骨素的方法。.季銨鹽沉淀法： 硫酸軟骨素在溶液中以聚陰離子形式存在， 與季銨鹽類(lèi)化合物形成水溶性很小的季銨鹽絡(luò)合物， 這些絡(luò)合物在低離子強(qiáng)度的水溶液中不溶解， 但當(dāng)其增大到臨界離子強(qiáng)度時(shí)， 可發(fā)生解離并溶解，利用該性質(zhì)可使硫酸軟

10、骨素得到分離純化。離子交換色譜法：是依靠庫(kù)侖力的作用將物質(zhì)吸附在交換劑上，然后選用合適的洗脫劑進(jìn)行洗脫， 達(dá)到其純化的目的。 常用于硫酸軟骨素純化陰離子交換劑有樹(shù)脂、纖維素和葡聚糖凝膠等。電泳法：根據(jù)化合物所帶電荷類(lèi)型和數(shù)量的不同， 采用電泳法可將硫酸軟骨素和其他雜質(zhì)分離開(kāi)。 電泳法具有分辨率、 目標(biāo)純度和回收率較高的特點(diǎn)。四、酶法制作工藝實(shí)驗(yàn)流程：1、具體提取方法：從鱘魚(yú)頭中取出軟骨，洗凈，切成小塊，置于大燒杯中 100水浴加熱 12h，中途換水兩次以除去表層油脂，冷卻后漂洗，瀝干水后送入 60干燥箱干燥約 5h，干燥完全后粉碎得到軟骨粉。.稱(chēng)取一定量軟骨粉， 根據(jù)一定的固液比加蒸餾水溶解酶

11、， 放入搖床恒溫反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間中間時(shí)刻調(diào)加入胃蛋白酶直至反應(yīng)完全。 反應(yīng)液水浴加熱進(jìn)行酶滅活處理，冷卻后調(diào)至中性，離心取清夜，并加入清液體積的兩倍乙醇進(jìn)行沉淀， 邊加入乙醇邊攪拌， 放入冰箱靜置24h，離心取沉淀，沉淀送入 50干燥箱干燥約 3h，得硫酸軟骨素粗品。酶反應(yīng)溫度過(guò)高會(huì)引起酶失活， 溫度過(guò)低酶活性不高， 木瓜蛋白酶最適溫度 50 60，胃蛋白酶不耐低溫，胰蛋白酶最適溫度為 45. 本實(shí)驗(yàn)綜合三種酶最適溫度，設(shè)定反應(yīng)溫度為 38，故溫度不作為單因素考慮。1）酶濃度因素：酶濃度不同，其他因素相同，隨著酶濃度的提高，粗品提取率隨之升高， 但酶濃度升高到一定值（ 15mg/g), 提取率不

12、再增大。2）時(shí)間因素：反應(yīng)時(shí)間不同，其他因素相同，隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)，粗品提取率隨之升高，但反應(yīng)時(shí)間超過(guò)50h，提取率雖然有所增長(zhǎng)，但增長(zhǎng)空間不大。 另外，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 得到的產(chǎn)品顏色加深，提取時(shí)間應(yīng)以軟骨全部溶解為準(zhǔn)。3）固液比因素：固液比不同，其他因素相同，隨著固液比的增高，粗品提取率隨之升高，但固液比升高到一定值（1:12 ），提取率不再增大。原理：硫酸軟骨素分子具有很高的吸濕性，因?yàn)槠渲械牧蛩彳浌撬胤肿邮且远嗑坳庪x子的形式存在的羧基和硫酸基可吸附帶正電.荷的水分子，吸附相當(dāng)于自身重量的數(shù)百倍的水分。在反應(yīng)體系中，大部分水分子和硫酸軟骨素因靜電作用結(jié)合， 并非游離態(tài)，因此反應(yīng)溶液的粘度

13、大，結(jié)合酶動(dòng)力學(xué)說(shuō)，底物分子與酶分子的碰撞概率減小，反應(yīng)速率低。故高固液比，可使溶液變稀，降低溶液的粘度，從而提高提取率。2、硫酸軟骨素各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定方法1 ）葡萄糖醛酸含量測(cè)定采用咔唑比色法，繪制葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線2 ）樣品純度測(cè)定采用咔唑比色法，繪制硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線3 ）蛋白質(zhì)的標(biāo)定取不同濃度牛血清白蛋白， 采用考馬斯亮藍(lán)法， 測(cè)其 595nm處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4 ）脂肪含量測(cè)定依據(jù) GB50009.6-85，索氏抽提法測(cè)定硫酸軟骨素中脂肪含量。5 ）PH測(cè)定五、綜述1 、原料中除含有蛋白多糖外， 還有大量的蛋白質(zhì)、 無(wú)機(jī)鹽、脂肪、結(jié)締組織及殘留的肌肉。 為了提高硫酸軟骨素的純度， 首先應(yīng)盡量去除軟骨上的肌肉、脂肪、結(jié)締組織；其次，應(yīng)將軟骨盡量粉碎，以提高提取率和降低浸提時(shí)間； 另外，硫酸軟骨素的提取率和純度高低與所采用的原料部位有關(guān)。.2、酶法反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，不會(huì)引起硫酸軟骨素的降解，固液比越高， 得率越高，最后達(dá)到平衡。 但快速反應(yīng)也可能使反應(yīng)體系升溫，引起蛋白質(zhì)和粘多糖的分解并