青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

1、1友情提示友情提示：以下內(nèi)容可能會(huì)讓您稍感不適，請(qǐng)“小心小心”觀看！ By Police、little red and simon 23456青霉素的發(fā)現(xiàn)青霉素的發(fā)現(xiàn) 1928年，英國(guó)倫敦大學(xué)圣瑪莉醫(yī)學(xué)院細(xì)年，英國(guó)倫敦大學(xué)圣瑪莉醫(yī)學(xué)院細(xì)菌學(xué)教授弗萊明在他一間簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室菌學(xué)教授弗萊明在他一間簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室里研究導(dǎo)致人體發(fā)熱的葡萄球菌。由于里研究導(dǎo)致人體發(fā)熱的葡萄球菌。由于蓋子沒(méi)有蓋好，他發(fā)覺培養(yǎng)細(xì)菌用的瓊蓋子沒(méi)有蓋好，他發(fā)覺培養(yǎng)細(xì)菌用的瓊脂上附了一層青霉菌。這是從樓上的一脂上附了一層青霉菌。這是從樓上的一位研究青霉菌的學(xué)者的窗口飄落進(jìn)來(lái)的。位研究青霉菌的學(xué)者的窗口飄落進(jìn)來(lái)的。使弗萊明感到驚訝的是

2、，在青霉菌的近使弗萊明感到驚訝的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不見了。這個(gè)偶然的旁，葡萄球菌忽然不見了。這個(gè)偶然的發(fā)現(xiàn)深深吸引了他，他設(shè)法培養(yǎng)這種霉發(fā)現(xiàn)深深吸引了他，他設(shè)法培養(yǎng)這種霉菌進(jìn)行多次試驗(yàn)，證明青霉素可以在幾菌進(jìn)行多次試驗(yàn)，證明青霉素可以在幾小時(shí)內(nèi)將葡萄球菌全部殺死。弗萊明據(jù)小時(shí)內(nèi)將葡萄球菌全部殺死。弗萊明據(jù)此發(fā)明了葡萄球菌的克星此發(fā)明了葡萄球菌的克星青霉素。青霉素。7 1940年，英國(guó)年，英國(guó)Florey和和Chain進(jìn)一步研進(jìn)一步研究此菌，并從培養(yǎng)液中制出了干燥的青霉究此菌，并從培養(yǎng)液中制出了干燥的青霉素制品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明，它毒性素制品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明，它毒性很小，

3、并對(duì)一些革蘭氏陽(yáng)性菌所引起的許很小，并對(duì)一些革蘭氏陽(yáng)性菌所引起的許多疾病有卓越療效。多疾病有卓越療效。89 青霉素通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁四肽側(cè)鏈和五肽交連橋的結(jié)合而阻礙細(xì)胞壁合成而發(fā)揮殺菌作用。青霉素的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞壁的成分粘肽結(jié)構(gòu)中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可與后者競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)肽酶，阻礙粘肽的形成，造成細(xì)胞壁的缺損，使細(xì)菌失去細(xì)胞壁的滲透屏障，對(duì)細(xì)菌起到殺滅作用。 其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，由于革蘭陰性菌缺乏五肽交連橋而青霉素對(duì)其作用不大。10青霉素的臨床應(yīng)用青霉素的臨床應(yīng)用青霉素臨床上用于治療葡萄球菌傳染癥如腦青霉素臨床上用于治療葡萄球菌傳染癥如腦膜炎、化膿炎、骨髓炎等，溶血性鏈球菌傳膜炎、化膿炎、骨髓炎

4、等，溶血性鏈球菌傳染癥如腹膜炎、產(chǎn)褥熱，以及染癥如腹膜炎、產(chǎn)褥熱，以及肺炎肺炎、淋病、淋病、梅毒和炭疽等。梅毒和炭疽等。11青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程賈希蒙 涂晨曉 冀振紅12青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝13菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)通過(guò)自然育種、誘變育種等方法，挑選出高產(chǎn)、穩(wěn)定、高效價(jià)菌種。產(chǎn)黃青霉 斜面孢子（25C，孢子培養(yǎng)，7d） 大米孢子（26C，孢子培養(yǎng)，56h） 一級(jí)種子培養(yǎng)液（27C，種子培養(yǎng)，24h） 二級(jí)種子培養(yǎng)液（2726C，發(fā)酵，7d）。種子罐級(jí)數(shù)是在指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。青霉素

5、種子制備一般為二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。 種子罐的目的是使接入有限的孢子迅速發(fā)芽、生長(zhǎng)、繁殖成大量菌體。 其中的培養(yǎng)基組分包括碳源（蔗糖）和氮源（玉米漿），及無(wú)機(jī)鹽（碳酸鈣）等。 將一級(jí)培養(yǎng)中得到的生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯，無(wú)雜菌及異常的菌體接種至發(fā)酵罐進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)。 接種量一般在10%20%。14 染菌是發(fā)酵工業(yè)長(zhǎng)期以來(lái)不能徹底解染菌是發(fā)酵工業(yè)長(zhǎng)期以來(lái)不能徹底解決的問(wèn)題，因此如何解決染菌問(wèn)題就成了決的問(wèn)題，因此如何解決染菌問(wèn)題就成了發(fā)酵工業(yè)的工作重點(diǎn)之一。要解決染菌問(wèn)發(fā)酵工業(yè)的工作重點(diǎn)之一。要解決染菌問(wèn)題首要問(wèn)題就是要能檢測(cè)出是否染菌。題首要問(wèn)題就是要能檢測(cè)出是否染菌。 染菌通常通過(guò)三個(gè)途

6、徑發(fā)現(xiàn)：無(wú)菌試染菌通常通過(guò)三個(gè)途徑發(fā)現(xiàn)：無(wú)菌試驗(yàn)，發(fā)酵液直接鏡檢，發(fā)酵液的生化分析。驗(yàn)，發(fā)酵液直接鏡檢，發(fā)酵液的生化分析。其中無(wú)菌試驗(yàn)是判斷染菌的主要依據(jù)。其中無(wú)菌試驗(yàn)是判斷染菌的主要依據(jù)。 15 染菌在發(fā)酵過(guò)程的每個(gè)階段都可能發(fā)生，下面就染菌在發(fā)酵過(guò)程的每個(gè)階段都可能發(fā)生，下面就各個(gè)不同的階段的染菌情況和處理辦法一一說(shuō)明。各個(gè)不同的階段的染菌情況和處理辦法一一說(shuō)明。 種子培養(yǎng)期染菌種子培養(yǎng)期染菌 發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵中期染菌發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期染菌 1617181920青霉素的發(fā)酵過(guò)程控制青霉素的發(fā)酵過(guò)程控制 1. 1.基質(zhì)濃度基質(zhì)濃度 2. 2.培養(yǎng)基成分的控制培養(yǎng)

7、基成分的控制 3.pH 3.pH值、溶氧值、溶氧 4. 4.溫度溫度 5. 5.補(bǔ)料控制補(bǔ)料控制 6. 6.泡沫的控制泡沫的控制21 1.基質(zhì)濃度基質(zhì)濃度 ： 在發(fā)酵過(guò)程中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過(guò)高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制（如葡萄糖的阻遏和抑制抑制（如葡萄糖的阻遏和抑制 , 苯乙酸的生長(zhǎng)抑苯乙酸的生長(zhǎng)抑制）制）, 而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成合成 。 所以，所以， 在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法作法 ，以維持

8、一定的最適濃度，以維持一定的最適濃度 。222.培養(yǎng)基成分的控制培養(yǎng)基成分的控制 : （1）碳源）碳源: 碳源的主要作用是為微生物菌種的生長(zhǎng)繁殖提供碳源的主要作用是為微生物菌種的生長(zhǎng)繁殖提供能源和合成菌體所必需的碳成分；為合成目的產(chǎn)物能源和合成菌體所必需的碳成分；為合成目的產(chǎn)物提供所需的碳成分。青霉素發(fā)酵中常用乳酸或葡萄提供所需的碳成分。青霉素發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最為糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最為便宜便宜，但因貨源較少，很多國(guó)家采用葡萄糖代替。但因貨源較少，很多國(guó)家采用葡萄糖代替。 目前普遍采用淀粉的酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流目前普遍采用淀粉

9、的酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流加，加，以降低成本。以降低成本。23（2）氮源）氮源: 氮源的作用是供應(yīng)菌體合成氨基酸和三肽的原氮源的作用是供應(yīng)菌體合成氨基酸和三肽的原料，以進(jìn)一步合成青霉素。主要有機(jī)氮源為玉米料，以進(jìn)一步合成青霉素。主要有機(jī)氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通氣及氧的傳遞，因而利用率較高。氣及氧的傳遞，因而利用率較高。 2425 （4）前體：）前體： 前體的加入是青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問(wèn)題之一。前體的加入是青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問(wèn)題之一。 添加苯乙酸或者

10、苯乙酰胺，可以借?；D(zhuǎn)移的作用，添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基轉(zhuǎn)移的作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素G的生產(chǎn)強(qiáng)度。的生產(chǎn)強(qiáng)度。 但但苯乙酸對(duì)發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有采用苯苯乙酸對(duì)發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)劑及發(fā)酵液消結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價(jià)格較貴。沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價(jià)格較貴。 前體要在發(fā)酵開始前體要在發(fā)酵開始20h后加入

11、，并在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中后加入，并在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中控制在控制在50g/ml左右。前體用量大于左右。前體用量大于0.1%時(shí)，青霉素的生時(shí)，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在0.1%為宜為宜。26 3.pH ： 在青霉素發(fā)酵過(guò)程中，在青霉素發(fā)酵過(guò)程中，pH是通過(guò)下列手段控是通過(guò)下列手段控制的：如制的：如pH過(guò)高，則添加糖、硫酸或無(wú)機(jī)氮源；過(guò)高，則添加糖、硫酸或無(wú)機(jī)氮源；若若pH過(guò)低，則加入碳酸鈣、氫氧化鈉、氨或尿素，過(guò)低，則加入碳酸鈣、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。另外，也可利用自動(dòng)加入酸或也可提高通氣量。另外，也可利用

12、自動(dòng)加入酸或堿的方法，使發(fā)酵液堿的方法，使發(fā)酵液pH維持在維持在6.87.2，以提高，以提高青霉素產(chǎn)量。青霉素產(chǎn)量。 274.溫度：溫度： 青霉菌生長(zhǎng)的適宜溫度為青霉菌生長(zhǎng)的適宜溫度為30，而分泌青霉，而分泌青霉素的適宜溫度是素的適宜溫度是20左右，因此生產(chǎn)上采用變溫左右，因此生產(chǎn)上采用變溫控制的方法，使之適合不同階段的需要。一般一控制的方法，使之適合不同階段的需要。一般一級(jí)種子的培養(yǎng)溫度控制在級(jí)種子的培養(yǎng)溫度控制在271左右；二級(jí)種左右；二級(jí)種子的培養(yǎng)溫度控制在子的培養(yǎng)溫度控制在251左右；發(fā)酵前期和左右；發(fā)酵前期和中期的溫度控制在中期的溫度控制在26左右；發(fā)酵后期的溫度控左右；發(fā)酵后期的溫

13、度控制在制在24左右。左右。 28 5.補(bǔ)料控制：補(bǔ)料控制： 發(fā)酵過(guò)程中除以中間補(bǔ)糖控制糖濃度及發(fā)酵過(guò)程中除以中間補(bǔ)糖控制糖濃度及pH外，補(bǔ)加外，補(bǔ)加氮源也可提高發(fā)酵單位。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)：若在發(fā)酵氮源也可提高發(fā)酵單位。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)：若在發(fā)酵6070h開始分次補(bǔ)加硫酸銨，則在開始分次補(bǔ)加硫酸銨，則在90h后菌絲含氮量幾乎不下降，后菌絲含氮量幾乎不下降，維持在維持在6%7%，且，且60%70%的菌絲處于年幼階段，的菌絲處于年幼階段，菌絲呼吸強(qiáng)度維持在二氧化碳量近菌絲呼吸強(qiáng)度維持在二氧化碳量近30l/（mg菌絲菌絲h），），抗生素產(chǎn)率為最高水平的抗生素產(chǎn)率為最高水平的30%40%；而不加硫酸銨的對(duì)；而不加

14、硫酸銨的對(duì)照罐，在發(fā)酵中期菌絲含氮量為照罐，在發(fā)酵中期菌絲含氮量為7%，以后逐級(jí)下降。至，以后逐級(jí)下降。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為發(fā)酵結(jié)束時(shí)為4%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)呼吸強(qiáng)度降至二氧化碳量。發(fā)酵結(jié)束時(shí)呼吸強(qiáng)度降至二氧化碳量為為16l/（mg菌絲菌絲h），且抗生素產(chǎn)量下降至零，總產(chǎn)量），且抗生素產(chǎn)量下降至零，總產(chǎn)量?jī)H為試驗(yàn)罐的僅為試驗(yàn)罐的1/2。因此，為了延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高青霉。因此，為了延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高青霉素產(chǎn)量，發(fā)酵過(guò)程分次補(bǔ)加氮源也是有效的措施。素產(chǎn)量，發(fā)酵過(guò)程分次補(bǔ)加氮源也是有效的措施。296.泡沫高度的控制：泡沫高度的控制： 在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫，可以用天然油脂在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫，可以用天然油脂如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑來(lái)消泡。如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑來(lái)消泡。30 青霉素的工業(yè)提取常采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)青霉素的工業(yè)提取常采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對(duì)青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁純濃縮。選擇對(duì)青霉素分配系數(shù)高