慢病毒包裝原理-介紹

1、慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應用一、慢病毒包裝簡介及其用途慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果， 在美國已經開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。目前慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。由于有些類型細胞脂質體轉

2、染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成 siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的， 因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體，然后轉移到細胞內轉錄siRNA的策略，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制 效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用。在所構建的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶川啟動子來指導 RNA合 成的，這是因為 RNA聚合酶川有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶poly A尾。當RNA聚合酶川遇到連續(xù) 4個或5個T時，它指導的轉錄就會停止， 在轉

3、錄產物3' 端形成14個U。 U6和H1 RNA啟動子是兩種 RNA聚合酶川依賴的啟動子，其特點是 啟動子自身元素均位于轉錄區(qū)的上游，適合于表達21ntRNA和50ntRNA莖環(huán)結構(stem loop )。在siRNA表達載體中，構成 siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動 子分別轉錄，然后兩條鏈互補結合形成siRNA ;也可由載體直接表達小發(fā)卡狀RNA(smallhairpin RNA, shRNA)，載體包含位于 RNA聚合酶川啟動子和 45 T轉錄終止位點之間 的莖環(huán)結構序列，轉錄后即可折疊成具有14個U 3 '突出端的莖環(huán)結構，在細胞內進一步加工成siRNA。構建載

4、體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的 siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。慢病毒載體(Len tiviral vector)較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產生表達 shRNA的高滴度的慢病毒， 在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA，實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息

5、。慢病毒包裝質?？商峁┧械霓D錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆 粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。overfwgoverhangdsRNAsiRNA YxyxwoovDtcer-RDE-1 complexMA targetingrnflNA WX/WWXJQfflfipWWVWW PoiyWAntisenseR|strandmRNA cleavageX

6、AAAAAAAAVVAAAAAA/PotywDegraded mRNA二、這一系統(tǒng)的目的，主要是為了解決以下問題:1. 對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi，cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。2. 進行穩(wěn)轉細胞株的篩選；3. 為活體動物模型實驗提供高質量的包含目的基因的病毒液；在細胞相關的實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉染甚至無法轉染的細胞，通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。三、慢病毒載體介紹慢病毒載體(Lentivi

7、ral vector, LVs)是在HIV-1 病毒基礎上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因(或 RNAi )導入動物和人的原代細胞或細胞系。慢病毒載體基 因組是正鏈RNA，其基因組進入細胞后，在細胞漿中被其自身攜帶的反轉錄酶反轉為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄mRNA,回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產生 RNAi干擾。慢病毒載體介導的基因表達或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，

8、比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關病毒載體、只整合分裂細胞的傳統(tǒng)逆轉錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻研究表明，慢病毒載體介導的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝臟、肌肉、視網膜、造血 干細胞、骨髓間充質干細胞、巨噬細胞等。慢病毒載體不表達任何 HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位無細胞免疫反應，體液免疫 反應也較低，不影響病毒載體的第2次注射。四、慢病毒載體的構建1. 構建原理慢病毒屬于逆轉錄病毒科，但其基因組結構復雜，除gag、pol和env這3個和單純逆轉錄病毒相似的結構基因外，還包括4個輔助基因，vif、vpr、nef、vpu和2個調節(jié)基因tat和rev 。HIV 21是慢

9、病毒中最具特征性的病毒，第一個慢病毒載體系統(tǒng)即以此病毒為基 礎進行構建的。慢病毒載體的構建原理就是將HIV 21基因組中的順式作用元件 （如包裝信號、長末端重復序列 ）和編碼反式作用蛋白的序列進行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和 載體成分：包裝成分由 HIV 21基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構 建，能反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補，含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV 21順式作用序列。同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插 入的目的基因。為降低兩種成分同源重組產生有復制能力的病毒（RCV ）的可能性，將包裝成分的5 ' LTR換成巨細

10、胞病毒（CMV ）立即早期啟動子，3 ' LTR換成SV 40 polyA 位點等。將包裝成分分別構建在兩個質粒上，即一個表達gag和pol、另一個表達env。根據這個原理，Naldi ni和Kafri 等構建了三質粒表達系統(tǒng)。2. 三質粒表達系統(tǒng)三質粒表達系統(tǒng)包括包裝質粒、包膜蛋白質粒和轉移質粒。其中包裝質粒在CMV啟動子的控制下，表達HIV 21復制所需的全部反式激活蛋白，但不產生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu;包膜蛋白質粒編碼水泡性口炎病毒G蛋白（V SV 2G），應用VSV 2G包膜的假構型慢病毒載體擴大了載體的靶細胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩(wěn)定性，允許通過高速離心對載體進行

11、濃縮，提高了滴度；轉移質粒中除含有包裝、逆轉錄及整合所需的順式序列，還保留350 bp的gag和RRE,并在其中插入目的基因或標志基因 （綠色熒光蛋白GFP）。將 載體系統(tǒng)分成三個質粒最大的益處是使序列重疊的機會大大減少，減少載體重組過程中產生RCV的可能性。通過三質粒共轉染293T細胞，超速離心后病毒滴度可達109IU /m l 。3. 四質粒表達系統(tǒng)為了減少HIV 21包裝結構的序列同源性，進一步減少重組成RCV的可能性，Dull等人將輔助基因去除。但由于 gag2pol的轉運需要rev ,因此，在上述的三質粒系統(tǒng)的基礎上， 構建成四質粒表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)加上含rev的質粒減少了產生 RCV的可能性，而且對非分裂期細胞轉導效率無影響。五、慢病毒載體應用1. 將目的基因/RNAi基因轉入難以轉染的細胞， 比