慢病毒包裝原理-介紹

1、慢病毒包裝系統(tǒng)簡(jiǎn)介及應(yīng)用一、慢病毒包裝簡(jiǎn)介及其用途慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果， 在美國(guó)已經(jīng)開(kāi)展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

2、染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成 siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的， 因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制 效果也不遜色于體外合成siRNA，在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶川啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo) RNA合 成的，這是因?yàn)?RNA聚合酶川有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會(huì)帶poly A尾。當(dāng)RNA聚合酶川遇到連續(xù) 4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停止， 在轉(zhuǎn)

3、錄產(chǎn)物3' 端形成14個(gè)U。 U6和H1 RNA啟動(dòng)子是兩種 RNA聚合酶川依賴的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是 啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)21ntRNA和50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop )。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成 siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng) 子分別轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA ;也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(smallhairpin RNA, shRNA)，載體包含位于 RNA聚合酶川啟動(dòng)子和 45 T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有14個(gè)U 3 '突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載

4、體前通常要通過(guò)合成siRNA的方法，尋找高效的 siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體。慢病毒載體(Len tiviral vector)較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá) shRNA的高滴度的慢病毒， 在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)shRNA，實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性。慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息

5、。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆 粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。overfwgoverhangdsRNAsiRNA YxyxwoovDtcer-RDE-1 complexMA targetingrnflNA WX/WWXJQfflfipWWVWW PoiyWAntisenseR|strandmRNA cleavageX

6、AAAAAAAAVVAAAAAA/PotywDegraded mRNA二、這一系統(tǒng)的目的，主要是為了解決以下問(wèn)題:1. 對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi，cDNA克隆以及報(bào)告基因的研究提供了一個(gè)有利的途徑。2. 進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選；3. 為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；在細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無(wú)法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過(guò)病毒介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率，以達(dá)到目的基因的高效瞬時(shí)表達(dá)。三、慢病毒載體介紹慢病毒載體(Lentivi

7、ral vector, LVs)是在HIV-1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因(或 RNAi )導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基 因組是正鏈RNA，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA,回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生 RNAi干擾。慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，

8、比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻(xiàn)研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長(zhǎng)期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血 干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。慢病毒載體不表達(dá)任何 HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位無(wú)細(xì)胞免疫反應(yīng)，體液免疫 反應(yīng)也較低，不影響病毒載體的第2次注射。四、慢病毒載體的構(gòu)建1. 構(gòu)建原理慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，但其基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除gag、pol和env這3個(gè)和單純逆轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)基因外，還包括4個(gè)輔助基因，vif、vpr、nef、vpu和2個(gè)調(diào)節(jié)基因tat和rev 。HIV 21是慢

9、病毒中最具特征性的病毒，第一個(gè)慢病毒載體系統(tǒng)即以此病毒為基 礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建的。慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將HIV 21基因組中的順式作用元件 （如包裝信號(hào)、長(zhǎng)末端重復(fù)序列 ）和編碼反式作用蛋白的序列進(jìn)行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和 載體成分：包裝成分由 HIV 21基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu) 建，能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補(bǔ)，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV 21順式作用序列。同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插 入的目的基因。為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒（RCV ）的可能性，將包裝成分的5 ' LTR換成巨細(xì)

10、胞病毒（CMV ）立即早期啟動(dòng)子，3 ' LTR換成SV 40 polyA 位點(diǎn)等。將包裝成分分別構(gòu)建在兩個(gè)質(zhì)粒上，即一個(gè)表達(dá)gag和pol、另一個(gè)表達(dá)env。根據(jù)這個(gè)原理，Naldi ni和Kafri 等構(gòu)建了三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。2. 三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。其中包裝質(zhì)粒在CMV啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)HIV 21復(fù)制所需的全部反式激活蛋白，但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu;包膜蛋白質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒G蛋白（V SV 2G），應(yīng)用VSV 2G包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴(kuò)大了載體的靶細(xì)胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩(wěn)定性，允許通過(guò)高速離心對(duì)載體進(jìn)行

11、濃縮，提高了滴度；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中除含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列，還保留350 bp的gag和RRE,并在其中插入目的基因或標(biāo)志基因 （綠色熒光蛋白GFP）。將 載體系統(tǒng)分成三個(gè)質(zhì)粒最大的益處是使序列重疊的機(jī)會(huì)大大減少，減少載體重組過(guò)程中產(chǎn)生RCV的可能性。通過(guò)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，超速離心后病毒滴度可達(dá)109IU /m l 。3. 四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)為了減少HIV 21包裝結(jié)構(gòu)的序列同源性，進(jìn)一步減少重組成RCV的可能性，Dull等人將輔助基因去除。但由于 gag2pol的轉(zhuǎn)運(yùn)需要rev ,因此，在上述的三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上， 構(gòu)建成四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)加上含rev的質(zhì)粒減少了產(chǎn)生 RCV的可能性，而且對(duì)非分裂期細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無(wú)影響。五、慢病毒載體應(yīng)用1. 將目的基因/RNAi基因轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 比