菌種保存、傳代、使用、銷毀管理規(guī)程_操作規(guī)程完整

1、菌種管理制度1、目的 建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范微生物學(xué)檢定用菌種的 管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的 準(zhǔn)確可靠。2、適用范圍 本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購(gòu)買、保存、傳代、使用及 銷毀等。3、定義標(biāo)準(zhǔn)菌株是指由中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干 燥菌。傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的采用特定保存方法長(zhǎng)期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱

2、為一代，從菌 種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0代。4、職責(zé)4.1 部門主管負(fù)責(zé)菌種的申購(gòu)、接收、保存分發(fā)。4.2 微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5、規(guī)程5.1 菌種的申購(gòu)部門主管根據(jù)菌種的使用情況，提出年度購(gòu)買計(jì)劃（包括臨時(shí)檢驗(yàn)需要），填寫申購(gòu) 流程，經(jīng)審批后，向中檢所菌種保藏中心或省 （市）藥檢所購(gòu)買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌株）或 傳代用菌種，購(gòu)買時(shí)，需確定菌種的代數(shù)，以便控制傳代代數(shù)。5.2 菌種的接收菌種到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，由部門主管接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整 性，同時(shí)將菌種的所有信息，填寫在標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)存記錄上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量、編 號(hào)（無(wú)編號(hào)者按檢定菌種的編

3、號(hào)原則編號(hào)）、代數(shù)、來(lái)源、接收日期、接收人等，并將其 暫貯存于48c冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。5.3 菌種的保存5.3.1 工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養(yǎng)基上 ，待菌生長(zhǎng) 充分以后，轉(zhuǎn)移至48c冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時(shí)檢查 其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時(shí)間根據(jù)菌種種類 而不同，細(xì)菌：每個(gè)月轉(zhuǎn)種一次；酵母菌及芽胞：36個(gè)月轉(zhuǎn)種一次；絲狀真菌每年轉(zhuǎn)種 .學(xué)習(xí)參考一次。5.3.2 傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。5.3.2.1 甘油冷凍管保存法用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷

4、凍復(fù)溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝入試管中的無(wú)菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號(hào)比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無(wú)菌甘油(濃度20%),即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無(wú)菌小試管，在 -30 C冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第 2代(G2)?？梢悦扛?年轉(zhuǎn)種一代。使用 時(shí)，取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復(fù)蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細(xì)菌和酵母菌的保藏(如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌)。5.3.2.2 液體石蠟保存法5.3.2.2.1 無(wú)

5、菌液體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用 牛皮紙包好，在121c滅菌30分鐘，置40c恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無(wú)菌檢查后備用。5.322.2液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下 培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺(tái)下用無(wú)菌吸管吸取上述無(wú)菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕,并將試管直立,置于-20C冷凍或28c冰箱 中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽抱桿菌的保存(如枯草芽抱桿菌、白 色念珠菌、黑曲霉菌等)。5.3.3各菌種的保存方法、條件及期限，見下表1表1傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱保存方法

6、保存溫度保存期限大腸埃希菌CMCC(B)44102甘油冷凍管-30 C2年金黃色葡錮球菌 CMCC(B)26003銅綠假單胞菌(CMCC (B) 10104)枯»抱的 CMCC(B)63501乙型副傷寒沙門菌 CMCC(B)50094白色念珠菌CMCC(F)98001液體石蠟管2-8 C1年黑曲霉菌CMCC(F)980035.4菌種的處理和保藏5.4.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代5.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇5.4.1.1.1 物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2 培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：用

7、于生抱梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙 門菌、短小芽抱桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯；改良馬丁培養(yǎng)基：用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯5.4.1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇操作步驟：以下操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。a）在安甑的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。b）用一小砂輪在安甑的上部劃一條線，用手輕輕將安甑掰開（開啟安甑時(shí)必須小心，因 為安甑遇熱時(shí)可能會(huì)破裂）。c）以無(wú)菌方法用一無(wú)菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8 ml到安甑中。d）輕輕地旋轉(zhuǎn)安甑以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。e）用無(wú)菌吸管將安甑內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相

8、應(yīng)的液體培養(yǎng)基。f）根據(jù)安甑上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度 3035 C ,培養(yǎng)1824小時(shí)；真菌培養(yǎng)溫度2328 C ,培養(yǎng)35天。觀察是否渾濁，渾 濁說(shuō)明菌種復(fù)蘇生長(zhǎng)；若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至 7天，真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間 至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。g）若黑曲霉為菌懸液，則先放置室溫待菌懸液融化后用無(wú)菌吸管吸取管內(nèi)液體12滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置2328c培養(yǎng)57天,斜面正面為黑 褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色，斜面?zhèn)让鏌o(wú)色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確 認(rèn)后用含有0.05% （ml/ml ）的吐溫-80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗脫到

9、無(wú)菌試管中。h）取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液 8-10ml至液體培養(yǎng)基中按f）項(xiàng)操作對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯。以 無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%的無(wú)菌甘油混勻，12ml/管，分裝于凍存管。每個(gè)菌種制備10支，按順序進(jìn)行編號(hào)，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn) 行相應(yīng)的確認(rèn)，其余作為儲(chǔ)備管在-30 C冷凍條件下保存。黑曲霉按g）項(xiàng)下方法進(jìn)行 復(fù)壯，制成復(fù)壯后的抱子懸液20ml 0以無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種菌懸液中12ml/管加石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，封存于凍存管，置于 -20 C冷凍或28c冰箱中保存。制備10支，按順序進(jìn)行編號(hào)，最后一支做為質(zhì)控管 進(jìn)行質(zhì)量控制，

10、即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。將上述制備好的凍存管逐支粘 貼標(biāo)簽。內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號(hào)、編號(hào)、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。i）儲(chǔ)備菌種管制備成功，儲(chǔ)存于30 C,有效期為兩年。5.4.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的確認(rèn)a）用無(wú)菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到胰酪大豆陳瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（細(xì)菌）或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（真菌和酵母菌）平板上，或相應(yīng)的宜于該菌生長(zhǎng)的鑒別培養(yǎng)基平板 上。b）然后在3035 CF培養(yǎng)3天（細(xì)菌）；2025 CF培養(yǎng)5天（真菌和酵母菌）。c）培養(yǎng)后，首先觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取生長(zhǎng)旺盛的單一的純菌落， 劃線于平皿培養(yǎng)基，每種菌劃4個(gè)平皿，以便收

11、集較多的生長(zhǎng)旺盛的典型單菌落，進(jìn) 行保存和鑒定。d）鑒定時(shí)作革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及形態(tài)特征。必要時(shí)再做生化實(shí)驗(yàn)以進(jìn) 一步鑒定該菌種。e）若在該平板上發(fā)現(xiàn)有其它菌落生長(zhǎng)，則說(shuō)明操作有污染或菌種不純，應(yīng)將此被污染了 的培養(yǎng)物滅活處理，并尋找原因。應(yīng)根據(jù)其原因采取措施重新分離挑選純菌落。f） 菌種的確認(rèn)結(jié)果，記錄在菌種鑒定記錄上。g）各菌種的復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，見菌種復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件 （附件2） o5.4.1.3菌種的傳代5.4.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代a）按菌種說(shuō)明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適宜的增菌培養(yǎng)基內(nèi)，稱第1代（G1）,復(fù)壯后 轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當(dāng)溫度下培

12、養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，分離單個(gè)純種菌落，此為第2代 （G2）。b）菌種確認(rèn)后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管或液體石蠟管，作為保存菌種（G2）,也稱傳代用菌種，同時(shí)挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作 用菌種，此為第3代（W3）。c）將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后 用于日常檢驗(yàn)。d）取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上。平板上的菌種制成 冷凍保存管第3代（G3）;斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用作工作 用菌種，此仍為第3代（W3）。e）將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存,將生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)種后的第2代（G2）菌種經(jīng)高

13、溫滅 活處理后丟棄。f）按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟冷凍干燥菌種，重復(fù)上述規(guī)程操 作，保存和使用菌種。g）當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，在規(guī)定保存期限內(nèi)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。5.4.1.3.2 傳代用菌的傳代將購(gòu)回?zé)o異常的傳代用菌種（一般為第3代），根據(jù)日常檢驗(yàn)工作的需要量，挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種（為第4代），同時(shí)，結(jié)合菌種的代數(shù)和最長(zhǎng)保 存期限，挑取純菌落制成濃菌懸液按“5.3.2 .的方法制備甘油冷凍管或液體石蠟管數(shù)支，作為傳代用菌種（仍為第3代）。5.4.1.3.2.1 傳代用菌的傳代操作步驟從冰箱冷藏室（28C）中取出菌種斜

14、面后,應(yīng)溫室放置約30min。將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基和傳代菌種一并移入生物安全柜內(nèi)，打開紫外燈照射1小時(shí)。關(guān)閉紫外燈。酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種 環(huán)，將接種環(huán)燒紅約30s,1.1.1 .3.2工作用菌種的傳代當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。取在冰箱48c保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔?，并將新傳代的培養(yǎng)物替代原有的 菌種，作為工作用菌種。也可取用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法”保存的菌 種，進(jìn)行復(fù)蘇，直接作為工作用菌種。細(xì)菌每1個(gè)月傳代一次；酵母菌每2個(gè)月傳代一 次；霉菌及芽胞每3個(gè)月傳代一次。當(dāng)超過5代，須用傳代用

15、菌種傳代。1.1.4 注意事項(xiàng)：傳代時(shí)注意無(wú)菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時(shí)實(shí)驗(yàn)人員也要采取有 效的預(yù)防措施進(jìn)行自我保護(hù)，如工作時(shí)必須穿工作服，佩帶無(wú)菌手套，實(shí)驗(yàn)完成以后消毒 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的區(qū)域、實(shí)驗(yàn)儀器和器具。如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學(xué)檢驗(yàn) 人員應(yīng)立即向部門主管報(bào)告以便及時(shí)進(jìn)行處理。1.1.5 傳代后，按檢定菌種的編號(hào)原則編號(hào)，并在每一支菌種管上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽內(nèi)容包 括：名稱、編號(hào)、代數(shù)、傳代日期、操作人、有效期。交部門主管統(tǒng)一保管。同時(shí)及時(shí)填 寫菌種傳代記錄（附表2）。5.5 檢定菌種的編號(hào)采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母一代次一傳代日期一順序號(hào)菌種的英文縮寫字母：大

16、腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽抱桿菌（B.（5） 色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷寒沙門菌（S.p）代數(shù)用一位 帶有下標(biāo)數(shù)字的字母表示：傳代用菌種用G表示；工作用菌種用W表示；如G3表示傳代 用菌種第3代；W3表示工作用菌種第3代。傳代日期用6位數(shù)字表示：年份取最后兩位數(shù)，月、日分別用兩位數(shù)。如：2015年1月 12日傳代的第一支大腸埃希菌作為傳代用菌種的編號(hào)為E.C-G3-120112-01 。5.6 檢定菌種的保管5.6.1 檢定菌種設(shè)專人加雙鎖保管，并對(duì)所保存的菌種建立檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬附表3）。5.6.2 檢定菌種的定期檢查與鑒定在菌種的保

17、存期間，工作日應(yīng)每天檢查保存菌種冰箱的溫度、必要時(shí)檢查菌種管的塞 子是否松動(dòng)，是否染雜菌等，并及時(shí)填寫檢定菌種觀察記錄附表4）,如有異常應(yīng)及 時(shí)處理。菌種在保存期內(nèi)均應(yīng)根據(jù)菌種的特性（工作用菌種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個(gè)月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)，必要時(shí)檢查生化特性等 項(xiàng)目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異較大，應(yīng)重新分離、純化、鑒定、再加以保存，并做好檢定 菌種鑒定記錄附表5）。5.6.3 所保管的菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個(gè)人，需要時(shí)應(yīng)有單位證明和批準(zhǔn)手續(xù)方可 供應(yīng)。5.7 檢定菌種的使用5.7.1 微生物學(xué)檢驗(yàn)人員根據(jù)檢驗(yàn)需要，需到部門主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，同

18、時(shí) 填寫檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬。5.7.2 微生物學(xué)檢驗(yàn)人員從部門主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，用于日常檢驗(yàn)或驗(yàn)證試驗(yàn)，使用后及時(shí)填寫檢定菌種使用登記臺(tái)賬附表6）,以便追蹤菌種使用歷史。5.7.3 菌液的制備：將新鮮的斜面菌種培養(yǎng)物用 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為 10-100cfu/ml的菌懸液，置于04QK箱冷藏，用于陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn),使用期24h ,濃菌液 放冰箱可保存一周。5.8 .檢定菌種（廢棄）的銷毀5.8.1 下列情況的菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用121 C、45分鐘濕熱滅活處理：a、新一代菌種制備成功后的上一代菌種；b、使用完后的菌種和帶有標(biāo)準(zhǔn)菌株的器

19、具和培養(yǎng)物；c、超過有效期的菌種；d、凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；e、其他應(yīng)廢棄的菌種。5.8.2 廢棄菌種的銷毀由微生物檢驗(yàn)員提出申請(qǐng)，交部門主管批準(zhǔn)后，進(jìn)行滅活處理，并有 其他人在場(chǎng)監(jiān)督,并填寫廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄附表7）。6、相關(guān)文件：初始污染菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、純化水檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 、中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等。7、注意事項(xiàng)：8.1、 微生物檢驗(yàn)人員最好生物相關(guān)專業(yè)，要經(jīng)過培訓(xùn)，取證上崗。8.2、 購(gòu)買菌種要保留相關(guān)證明，最好讓藥檢所開個(gè)證明，說(shuō)明購(gòu)買菌種的名稱、菌種代康氏加準(zhǔn)符(IVR-Furhiiid SUiiichird)曲:制體承.“4U港氏號(hào)人再映RQ人技到激、

20、數(shù)量等杷汶個(gè)證明附在陶神探受訶彳frnlJ細(xì)蔭裁 xiOMmi.L 1LSO4 (1%)(r S仆 Gc cH工上自七 E* rzrrl小心/.tF*/vsr工rr A 口口 47 任 E z_U & > 人/匚8.3、 困神早專代、便用在RU住岬U口,為傳8.4、 菌種常用的是10-100cfu/m_l門的菌懸液 如果是細(xì)菌T可參照麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管估算。切困怦和/、畀,取歹便用生物備石和o ,可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定制備方法.。一98 06.V9工。9.0XILtzi c L 人 -d-h-hemd-UL APrl _tx |=r從孵育18-24小時(shí)啊非這拜年相力基上,加丑3-5j伴r,旦

21、墳用內(nèi)以!肝哈巾卯以忘，回力接種，一冊(cè)將濁度調(diào)整至麥?zhǔn)吓ｃ鷺?biāo)準(zhǔn)管10方對(duì)以泡夏，然后稀驛。5.066.094.01SO支IXLL濁官配制方法：.Jre9302L00.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2 ；2H2O)、0.36NH 2SO4(1%V/V)山口將一液濕廿？直螺口試管中，購(gòu)書溫喑處保， 目測(cè)或使用電濁儀即可。1巾?，用前彈對(duì)。啟效期為6個(gè)月少應(yīng)用時(shí)ycxo30 （10號(hào)管對(duì)應(yīng)的菌濃度為30 X 108cfu/ml ,稀釋一般用無(wú)菌生理鹽水 （0.9%氯化鈉溶液）。8、附表附表1:檢定菌接收記錄附表2:檢定菌種傳代記錄附表3:檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬附表4:檢定菌種觀察記錄附表5:檢定菌種鑒定記錄附表6:檢定菌種使用登記臺(tái)賬附表7:被棄菌種