醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的后處理工程

1、第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞破碎與固液分離細(xì)胞破碎與固液分離 細(xì)胞壁由堅(jiān)固的多聚糖，乙酰葡萄糖胺和乙酰胞壁酸形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)，有一定的阻力，針對(duì)這種結(jié)構(gòu)，細(xì)胞破碎方法分為機(jī)械和非機(jī)械兩種方法。機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法高速勻漿法(High Pressure homogenizer)高速珠磨法(High-speed bead mill)超聲破碎法(Ultrosonication)高壓擠壓法: 本方法是用特殊裝置X-Press擠壓機(jī).非機(jī)械破碎法非機(jī)械破碎法酶溶法酶溶法(Enzymatic Lysis): 常用的溶酶有溶菌酶(Lysozyme), 葡聚糖酶(Glucanase), 蛋白酶(Protease)

2、, 糖苷酶(Glycosidase), 甘露糖酶(Mannanase), 肽鍵內(nèi)切酶(Endopeptidase), 殼多糖酶(chitinase)等。2. 化學(xué)滲透法（化學(xué)滲透法（Chemical Permeation）: 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：a. 對(duì)目的產(chǎn)物的釋出有一定的選擇性； 細(xì)胞外形保持完整，碎片少，有利于進(jìn)一步分離純化； 分子量大的核酸釋出少，漿液黏度低，有利于提取；其缺點(diǎn)是： 操作時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)目的產(chǎn)物釋放率不超過(guò) 50%，而處理時(shí)間在2小時(shí)以上，因此為了防止活性損失往往需要加添還原劑（巰基乙醇）進(jìn)行保護(hù)； b. 有些化學(xué)試劑本身有毒性，進(jìn)一步分離純化時(shí)需通過(guò)透析等 b.

3、 方法除去所有試劑。固液分離固液分離離心沉淀: 離心是固液分離的主要手段,其中包括高速離心和超速離心.過(guò)濾: 過(guò)濾包括粗濾(布、金屬網(wǎng)、纖維濾器等)和膜過(guò)濾。第二節(jié)第二節(jié) 目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物的分離純化 目前分離純化最好的方法是色譜和電泳，但是受各種因素的限制，電泳遠(yuǎn)不能用于醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的規(guī)模生產(chǎn)上，因此色譜成為人們研究的重點(diǎn)。另外，雙水相萃取也是前期分離常用的方法。雙水相萃取雙水相萃取 雙水相系統(tǒng)由兩種水溶高聚物如聚乙二醇葡聚 糖(PEG-Destran)或一種高聚物與無(wú)機(jī)鹽在水溶液中 混合而成。因兩相均含有較多的水,所以稱之為雙水 相。常用的雙水相系統(tǒng)為PEG-Destran和無(wú)

4、機(jī)鹽。由于Destran價(jià)格高，因此PEG-無(wú)機(jī)鹽應(yīng)用更為廣泛。 與色譜分析相比。 雙水相萃取所能達(dá)到的純度還相差較遠(yuǎn)。二二. 色譜技術(shù)色譜技術(shù) 色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過(guò)程精制階段的常用手段。其優(yōu)點(diǎn)是具有多種分離機(jī)制、設(shè)備簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化控制以及分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等有害效應(yīng)。 色譜技術(shù)可分為分析色譜（10mg) 、半制備色譜（1050mg）、制備色譜（100mg10g）和工業(yè)性生產(chǎn)色譜（20g/d）。 在傳統(tǒng)的色譜技術(shù)基礎(chǔ)上，七十年代以來(lái)，發(fā)展起來(lái)的高效液相色譜（High Perfomance Liquid Chromatography HPLC）引人注目。HPLC的分離原理和常規(guī)色譜技術(shù)相

5、似，它的特點(diǎn)是具有專有的高壓輸液系統(tǒng)、靈敏的檢測(cè)設(shè)備和高效分離柱，其優(yōu)點(diǎn)是分離效率高、選擇性好，適用于各種多組分混合物的分離，它的應(yīng)用范圍幾乎包括了所有的物質(zhì)類型，從天然產(chǎn)物到合成產(chǎn)物，從小分子物質(zhì)到大分子物質(zhì)，從一般化合物到生物活性物等。HPLC既是精細(xì)的分離純化方法。也是快速靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的分析檢測(cè)手段。 體積排阻色譜 (Size Exclusion Chromatography, SEC) SEC一般能分離的分子量范圍為1200萬(wàn)；平均粒度為313。2. 離子交換色譜離子交換色譜 (Ion Exchange Chromatography, IEC) 離子交換色譜的基本原理是通過(guò)帶電的溶

6、質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離。 對(duì)生物大分子進(jìn)行分離純化可采用兩種方式： （1）. 是將目的產(chǎn)物離子化，被交換到介質(zhì)上，而雜質(zhì)不被吸附，從柱中流出，稱之為“正吸附”其優(yōu)點(diǎn)是目的產(chǎn)物純度高，而且可達(dá)到濃縮目的。 （2）. 另一種方式是將雜質(zhì)離子化后被交換，而且目的產(chǎn)物不被交換直接流出，這種方式稱之為“負(fù)吸附”。采用這種方法可除去50%70%的雜質(zhì)，適用于目的產(chǎn)物濃度較高的工作溶液。 反相色譜 (Reversed Phase Chromatography, RPC) : RPC是基于溶質(zhì)，極性流動(dòng)性和非極性固定相表 面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜方式。4. 疏水作用色譜 (Hy

7、drophobic Interaction Chromatography, HIC) HIC的原理與PCR相似，區(qū)別是HIC填料表面的疏水性沒(méi)有RPC強(qiáng)，可用填料有有機(jī)聚合物(交聯(lián)瓊脂糖 Sepharose12，乙烯聚合物等)和大孔硅膠鍵合相兩類。 親和色譜（Affinity Chromatography, AC） AC是利用生物大分子特異的親和力而建立的層析技術(shù)。親和分析的過(guò)程大致分為三步：a. 配基固定化，選擇合適的配基與不溶性支撐載體偶聯(lián)或共價(jià)結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)；b. 吸附目的物，親和層析介質(zhì)選擇性吸附目的蛋白，而雜質(zhì)與層析介質(zhì)間沒(méi)有親和作用，不被吸附，可經(jīng)洗滌去除；c. 樣

8、品解析：選擇合適的條件，將吸附在親和介質(zhì)上的目的物解析下來(lái)。抗體親和層析的步驟是：a. 用純化的目的基因蛋白質(zhì)產(chǎn)品免疫動(dòng)物，獲得 抗體；b. 把抗體置于親和層析柱上，然后使基因工程制 備的含有多種雜蛋白的混合液，通過(guò)層析柱， 具有目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可與柱上的抗體發(fā) 生親和結(jié)合；c. 洗脫柱上蛋白質(zhì)，可以得到高度純化的產(chǎn)物。電泳分離技術(shù)電泳分離技術(shù) 電泳技術(shù)分離純化的基本原理是：蛋白質(zhì)或多肽分子是含有可帶正電荷的氨基、亞氨基、酰胺基等和可帶負(fù)電的羧基、苯酚基、巰基等的兩性生物大分子，帶有正電荷的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)作用下向陰極方向移動(dòng)，而帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向陽(yáng)極方向移動(dòng)。 平板電泳： 平板電泳分

9、為水平平板電泳和垂直平板電泳 種方式。2. 連續(xù)凝膠電泳： 連續(xù)凝膠電泳實(shí)質(zhì)上是垂直聚丙烯酰胺凝膠平板電泳的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了在同批次連續(xù)把各個(gè)電泳區(qū)帶分離回收，并可進(jìn)行多批次的分離操作。 等點(diǎn)聚焦電泳: 含有多氨基，多羧基的一系列聚合物混合形成的兩性 電解質(zhì)，在電場(chǎng)作用下，可以形成一個(gè)從陽(yáng)極到陰極PH值 逐漸增加的PH梯度。當(dāng)不同的蛋白質(zhì)處在這種環(huán)境時(shí)，處 于比其等電點(diǎn)低的PH環(huán)境中的蛋白質(zhì)會(huì)帶正電荷，向陰極 方向移動(dòng)，反之向陽(yáng)極方向移動(dòng)，在移動(dòng)的過(guò)程中隨著環(huán) 境PH的改變，逐步達(dá)到與其等電點(diǎn)相同的PH環(huán)境中，這 是其所帶電荷為零在電場(chǎng)不再移動(dòng)而形成區(qū)帶，從而達(dá)到 不同蛋白質(zhì)分離的目的。4. 連續(xù)

10、流動(dòng)電泳： 連續(xù)流動(dòng)電泳是在紙電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，以濾紙為載體，將欲分離的樣品以固定方式不斷加在濾紙上（加陽(yáng)點(diǎn)位置根據(jù)組分的電泳行為確定）。在電場(chǎng)作用下帶不同電荷的組分隨電泳緩沖液向前流動(dòng)的同時(shí)，向不同電極方向移動(dòng)，在濾紙表面形成不同的拋物線狀的遷移軌跡，在濾紙末端剪成鋸齒狀，分別接收流出的各個(gè)組分，達(dá)到分離末端物的目的。 無(wú)載體連續(xù)流動(dòng)電泳: 這種電泳的原理是，含蛋白質(zhì)的溶液沿平板表 面流動(dòng)，形成液膜，在液膜兩側(cè)加上電極，隨著 液膜向前流動(dòng)的同時(shí)，又向電極方向遷移，形成 拋物線軌跡，使它們彼此分開(kāi)，分別收集即可達(dá) 到分離的目的.表表1. 某些生物大分子的分離和純化某些生物大分子的分離和純

11、化表2 幾種檢測(cè)目的物純度方法的比較第三節(jié)第三節(jié) 目的產(chǎn)物的質(zhì)量檢控目的產(chǎn)物的質(zhì)量檢控純度分析純度分析 常用的純度檢測(cè)方法有: PAGE、SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）、HPLC等，也可用一些化學(xué)方法，如觀察末端是否均一等。氨基酸分析氨基酸分析 氨基酸分析可以用自動(dòng)分析儀進(jìn)行，氨基酸分析可分為柱后反應(yīng)法和柱前反應(yīng)法兩類。重組蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定和分子量測(cè)定重組蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定和分子量測(cè)定 蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定；紫外法比較方便，又不損耗蛋白質(zhì)樣品。在未知摩爾消光系數(shù)的情況下，可以簡(jiǎn)單地測(cè)定280nm和260nm光吸收值，然后用公式計(jì)算： 蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.55A-0

12、.76A260 用考馬斯藍(lán)G-250測(cè)蛋白質(zhì)濃度時(shí)，是在酸性條件下使試劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，其特征吸收率由465nm轉(zhuǎn)移到595nm ，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)595nm的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成線形關(guān)系，因此可作為定量依據(jù)。 凝膠過(guò)濾法是測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的最常用的方法，已廣泛使用的是Sephadex系列（G-75，G-100等）和HPLC凝膠過(guò)濾系統(tǒng)。SDS-PAGE是實(shí)驗(yàn)室測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的常規(guī)方法。四四. 肽譜分析肽譜分析 肽譜分析是用酶解或化學(xué)降解（溴化氰法等）目的蛋白質(zhì)后對(duì)生成的肽段進(jìn)行的分解分析，它也是檢測(cè)目的產(chǎn)物的指標(biāo)之一。 蛋白質(zhì)的二硫鍵分析蛋白質(zhì)的二硫鍵分析 二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生

13、物活性密切相關(guān)，測(cè)定巰基的方法有PMCB法、DTNB法和NEMI法等?；蚬こ棠康漠a(chǎn)物的硫-硫鍵是否正確配對(duì)，是一個(gè)重要問(wèn)題，例如IL-2分子中有Cys-58和Cys-105形成的硫-硫鍵，而Cys-125是以游離巰基形式存在，如果發(fā)生錯(cuò)誤配對(duì)，不但生物活性只有原來(lái)的1/400而且會(huì)形成抗原性。為此用蛋白質(zhì)工程法將IL-2的Cys-125改為Ser或Ala，使其生物活性和熱穩(wěn)定性得以改善。目的物的生物活性測(cè)定目的物的生物活性測(cè)定 體外生物活性測(cè)定方法有靶細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、3H-TaR摻入法和酶法細(xì)胞計(jì)數(shù)等。體內(nèi)生物活性測(cè)定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué)模型。第四節(jié)第四節(jié) 目的產(chǎn)物的保存目的產(chǎn)物的保存液態(tài)保存液態(tài)保存低溫保存: 液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在-1020以下冷凍保存比較理想。2. 在穩(wěn)定PH條件下保存： 蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的PH一般在等電點(diǎn)。保存液態(tài)蛋白質(zhì)樣品時(shí)，應(yīng)小心調(diào)整到其穩(wěn)定的PH范圍內(nèi)。3. 在高濃度下保存： 一般蛋白質(zhì)在濃溶液中比較穩(wěn)定。4. 在保護(hù)劑存在下保存： 多數(shù)蛋白質(zhì)要求較為疏水的環(huán)境才能長(zhǎng)期保存，加入某些穩(wěn)定劑可以降低蛋白質(zhì)溶液的極性以免變性失活。這類蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑有糖