聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳和均一凝膠電泳在分離及鑒定植物SOD同

1、收稿日期:2008203212.基金項(xiàng)目:江蘇省自然科學(xué)基金(1998S WXOSZ001 資助項(xiàng)目.通訊聯(lián)系人:程光宇, 高級(jí)實(shí)驗(yàn)師, 研究方向:生物活性物質(zhì)及保健功能因子. E 2m iil:mx wcgyyahoo. com. cn聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳和均一凝膠電泳在分離及鑒定植物S OD 同工酶中的比較研究程光宇1, 王峰2, 陶明煊2, 陸長(zhǎng)梅1, 吳國(guó)榮1, 常福辰1(1. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇南京210097(2. 南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院, 江蘇南京210097 摘要比較了聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳(GPGE 和均一凝膠電泳(P AGE 在分離和鑒定S OD 同工酶方

2、面的應(yīng)用. 在GPGE 中根據(jù)R f 值大小可將S OD 譜帶分為3個(gè)區(qū):A 區(qū)Rf 值最小, 對(duì)S DS 敏感, 為Mn 2S OD; C 區(qū)Rf 值最大, 對(duì)S DS 不敏感, 為CuZn 2S OD; B 區(qū)譜帶Rf 值位于兩者之間, 對(duì)S DS 敏感, 為Fe 2S OD. 根據(jù)圖譜上譜帶Rf 值大小和對(duì)S DS 敏感性來(lái)判斷S OD , 的簡(jiǎn)便可行的方法, 相同植物材料經(jīng)P AGE . , S OD 靈敏度可達(dá)10-15mol, P AGE 為10-13mol; 在1156×-, P AGE 僅為2條.枸杞Fe 2S OD 在715%膠中R f 10%, Fe 2S OD

3、、Mn 2S OD 和朱桔Mn 2S OD 、CuZn 2S OD 在P , 可根據(jù)Rf 值大小鑒別S OD 類型. 通過2S OD 的可靠性, 它能有效地分離和鑒定在P AGE 上重疊的3種S OD 類型.關(guān)鍵詞, 聚丙烯酰胺凝膠電泳, S OD, 分離, 鑒定中圖分類號(hào)Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào)100124616(2008 0420097207Co m par ison of Grad i en t Polyacryl am i de and Polyacryl am i de GelElectrophoresis i n the Isol a ti on and I den ti f

4、 i ca ti on of Pl an t S OD Isozy m eCheng Guangyu 1,W ang Feng 2, Tao M inxuan 2, Lu Chang mei 1,W u Gongr ong 1, Chang Fuchen1(1. School of L ife Science, Nanjing Nor mal University, Nanjing 210097, China (2. J inling College, Nanjing Nor mal University, Nanjing 210097, China Abstract:This paper c

5、ompared the app licati on of gradient polyacryla m ide gel electr ophresis (GPGE and polyacryla m ide gel electr ophoresis (P AGE in is olati on and identificati on of p lant S OD is ozy me . The results showed that S OD bands on GPGE were divided int o three regi on of A, B, C according t o its Rf

6、. The Rf of A regi on S OD band was m ini m u m, it was sensitive t o 1%S DS and wasM n 2S OD. The Rf of C regi on S OD band was the biggest, it was not sensitive t o 1%S DS and was CuZn 2S OD. The R f of B regi on S OD band was bet w een A and C, it was sensitive t o 1%S DS and was Fe 2S OD. The th

7、ree S OD is ozy mes were distinguished by its R f and sensitivity t o S DS on polyacryla m ide gradient gel, this result was about the sa me as the result of judge ment using inhibit or . The sa me p lant sa mp le was is olated by P AGE did not have the characteristic . 10-13mol and 10-15mol bovine

8、S OD was detected in P AGE and GPGE, res pectively . Four and t w oS OD activity bands were detected in GPGE and P AGE at 1156×10-12mol bovine S OD, res pectively . The R f of Fe 2S ODfr om L ycium chinense was the biggest in 715%P AGE and it overlapped with CuZn 2S OD in 10%P AGE . The FeS OD

9、and M n 2S OD of cirus w ilsonii , Mn 2S OD and CuZn 2S OD of C itrus erythrosa were overlapped each other in 10%P AGE, but three types of S OD were comp letely is olated in 4%35%GPGE . The reliability of is olating and identify S OD using GPGE was expounded by t w o ti m es gel concentrati on gradi

10、ent electr ophoresis TGCGE, the Rf and the nu mber of S OD bands in GPGE were compatible with TGCGE, and it can comp letely is olate and identify the overlapped three S OD types on P AGE .Key words:GPGE, P AGE, S OD, Is olati on, I dentificati on79第31卷第4期2008年12月南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 JOURNAL OF NANJ I N G NO

11、R MAL UN I V ERSI TY (Natural Science Editi on Vol . 31No . 4Dec, 2008超氧化物歧化酶(EC11151111, 簡(jiǎn)稱S OD 是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類金屬酶, 根據(jù)金屬輔基的不同可分為Mn 2S OD 、Fe 2S OD 和CuZn 2S OD 3種類型, 近年來(lái)還從鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)了N i 2S OD 1, 從日本沼蝦中純化6611ku 的EC 2S OD , 發(fā)現(xiàn)了倉(cāng)鼠和人胞質(zhì)中的240260ku 及135和270ku 的EC 2S OD 2, 它們都具有催化超氧陰離子自由基形成過氧化氫和水的反應(yīng)能力, 在防御活性氧對(duì)生物

12、體的傷害、在植物的逆境生理、在預(yù)防和治療由自由基誘發(fā)的一系列疾病, 如腫瘤、輻射損傷、心腦血管疾病等方面都起到了很重要的作用. 對(duì)3種類型S OD 同工酶的分離和鑒定是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中會(huì)遇到的實(shí)際問題, 通常都是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(P AGE 的定位染色法3, 我們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)樣品點(diǎn)樣量少時(shí), S OD 弱帶難以顯示,點(diǎn)樣量大時(shí)植物次生物質(zhì)對(duì)酶帶顯示有干擾, 且譜帶清晰度和重復(fù)性都不理想, 時(shí)有譜帶重疊現(xiàn)象出現(xiàn), 譜帶分離的R f 值與酶類型間無(wú)特定規(guī)律可尋, 在改用聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳(GPGE 后得到了較滿意的效果. 本文將通過GPGE 和P AGE 的比較, 旨在建立用GPGE

13、分離和鑒定S OD 同工酶的新方法. 1材料和方法111材料、主要試劑及儀器新鮮的植物材料采自南京地區(qū)和本院溫室, , 枸杞Fe 2S OD 、牛血S OD 及花生2S OD 6. 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、S DS 、甲硫氨酸(Sig , , . 主要儀器為島津CS , -高壓電泳儀, 梯度凝膠電泳灌膠裝置.112方法11211S OD 將實(shí)驗(yàn)材料剪碎, 按每克鮮重加入3mL 的50mmol/L磷酸緩沖液(pH718 進(jìn)行研磨勻漿, 勻漿液10000r/min 離心15m in 后, 上清液即為粗酶液, 用于實(shí)驗(yàn)或分裝于小離心管內(nèi), -25保存?zhèn)溆? 11212S OD 同工酶的電泳分離和染

14、色定位P AGE 按羅廣華等3方法, 在715%或10%的分離膠上進(jìn)行; GPGE 按程光宇等7及張龍翔8方法, 在4%35%梯度膠上進(jìn)行, 加樣前以100V 穩(wěn)壓預(yù)電泳30m in, 加樣后在4電泳, 先以150V 穩(wěn)壓電泳1h后, 將電壓逐步提高到300V 穩(wěn)壓電泳15h (電泳持續(xù)4500V h 以上 ; 二次電泳按程光宇等9方法進(jìn)行, 第一向?yàn)?0%的P AGE, 在電泳結(jié)束后切取具有S OD 活性且未經(jīng)染色的區(qū)帶, 放在已預(yù)電泳過的4%35%梯度膠上端, 加入P AGE 中315%的濃縮膠液, 采用光照聚合將其固定后進(jìn)行第二向GPGE, 同時(shí)以相同酶液量在梯度膠上點(diǎn)樣. 電泳結(jié)束后進(jìn)

15、行酶活性染色, 采用拍照或掃描方法記錄S OD 同工酶圖譜. 11213S OD 同工酶類型的鑒定(1 參照B ridges 和Salin 的方法10, 以KCN 和H 2O 2兩種抑制劑鑒定S OD 類型.(2 利用梯度膠具有分子篩效應(yīng)8及其R f 值與3種S OD 相對(duì)分子質(zhì)量存在差異11的特點(diǎn), 由R f 值初步判斷S OD 類型.(3 利用CuZn 2S OD 對(duì)S DS 不敏感、Mn 2S OD 和Fe 2S OD 對(duì)S DS 敏感的特性11, 1219, 向粗酶液中加入S DS 溶液使其終濃度達(dá)1%后, 于37保溫1h, 分別進(jìn)行S OD 同工酶的GPGE 和P AGE 并進(jìn)行酶活

16、性染色. CuZn 2S OD 對(duì)S DS 不敏感, 譜帶留存,Mn 2S OD 和Fe 2S OD 對(duì)S DS 敏感, 譜帶消失.2結(jié)果與分析211GPGE 和P AGE 對(duì)分離S OD 同工酶的影響結(jié)果見圖1. 14種植物的3種類型S OD 在4%35%的梯度膠中都得到較好的分離, 譜帶清晰, 未見有干擾現(xiàn)象, 根據(jù)R f 值可分為A 、B 、C 3個(gè)區(qū)域:A 區(qū)的R f 值最小(<316 , 譜帶都為1條; C 區(qū)的R f 值最大(>510 , 其中譜帶數(shù)目因植物種類不同而異, 如羊蹄、拔契僅有12條, 而鴨趾草、馬兜鈴等則多于4條; B 區(qū)R f 值位于A 、B 區(qū)之間,

17、如有譜帶一般都為1條, 但許多植物缺乏這種類型譜帶. 同時(shí), 從其R f 值大小, 還可初步判定各同工酶的相對(duì)分子質(zhì)量和類型, R f 值最小的A 區(qū)同工酶相對(duì)分子質(zhì)量最大, 應(yīng)為Mn 2S OD; R f 最大的C 區(qū)同工酶相對(duì)分子質(zhì)量最小, 應(yīng)是CuZn 2S OD; 而介于兩者之間B 區(qū)的同工酶可認(rèn)為是Fe 2S OD, 如南苜蓿、金蕎麥的Fe 2S OD. 在S OD 類型的篩選中, 利用梯度膠這一分離特性為初步判斷89南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 第31卷第4期(2008年S OD 類型提供了一條快捷途徑.同一樣品在相同加樣量下進(jìn)行10%P AGE, S OD 譜帶分離效果遠(yuǎn)不如GPGE

18、, 譜帶分布及R f 值與S OD 類型之間無(wú)特定規(guī)律可尋, 其中紫花地丁中的次生物質(zhì)對(duì)S OD 顯示干擾并影響到周圍的譜帶(圖1的11 . 可見, 在P AGE 中S OD 的R f 值因受電荷、膠濃度、pH 值等多種因素影響, 不能作為S OD 類型鑒定的依據(jù), 在GPGE 中的R f 值排除了電荷等因素的影響, 與分子大小有相關(guān)性, 故它可用于測(cè)定天然酶和蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量8 .212GPGE 和P AGE 檢測(cè)S OD 的靈敏度和分辨率比較以牛血S OD 為標(biāo)準(zhǔn), 比較GPGE 和P AGE 檢測(cè)S OD 的靈敏度和分辨率(見圖2 . 當(dāng)以相同加樣量分別進(jìn)行GPGE 和P AGE 時(shí)

19、, 在P AGE 圖譜上S OD 的檢測(cè)濃度為1156×10-13mol, 在GPGE 圖譜上, S OD 濃度為1156×10-14mol 時(shí)譜帶清晰, 當(dāng)再稀釋10倍后仍能見到S OD 譜帶(圖片未列出 , 說明P AGE 和GPGE 檢測(cè)S OD 的靈敏度分別為1156×10-13mol 和1156×10-15mol . 在GPGE 圖譜中牛血S OD 活性染色與蛋白染色帶邊緣清晰, 呈扁平狀, 在1156×10-12mol S OD 時(shí)活性染色帶可分辨出1條主帶和2條次帶及1條弱帶(圖2中A3 , 與6124×10-9mol

20、S OD 時(shí)的蛋白帶相互對(duì)應(yīng)(圖2中B5 ; 而在同樣加樣量下的P AGE 圖譜中譜帶邊緣模糊, 只能分辨出1條主帶和1條次帶(圖2中C10 . 說明GPGE 比P AGE 有更高的分辨率 . 花生S OD 粗酶液(125U /mL 分別以1L 進(jìn)行GPGE 和P AGE 時(shí), 在GPGE 圖譜上Mn 2S OD 和CuZn 2S OD 譜帶非常清晰(圖2的13 , 但在P AGE 圖譜上已無(wú)明顯的譜帶(圖2的19 . 花生CuZn 2S OD 在GPGE 中分別加樣01016g 和01128g, 在P AGE 中分別加樣01032g 和0132g 時(shí), 低、高濃度S OD 譜帶掃描99程光宇

21、, 等:聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳和均一凝膠電泳在分離及鑒定植物S OD 同工酶中的比較研究后峰面積之比分別為13137和11154. 從圖1和圖4還能看出南苜蓿、番茄、金蕎麥等在梯度膠上顯示出45條帶, 但P AGE 圖譜上顯示23條. 純化的枸杞Fe 2S OD 有3條帶, 但在GPGE 上的靈敏度和分辨率明顯高于P AGE (圖3的4, 9 . 可見, 對(duì)于植物的粗酶液和純酶, GPGE 同樣比P AGE 有較高的靈敏度和分辨率.213不同膠濃度對(duì)3種S OD 類型分離和鑒定的影響枸杞和香櫞都含有3種類型S OD, 它們?cè)诓煌z濃度下的分離結(jié)果見圖3. 枸杞在715%P AGE 中有3條Fe

22、 2S OD, 它們的R f 最大, CuZn 2S OD 也有3條, 它們的R f 居中,Mn 2S OD 不成條帶, 很難確定. 在10%的P AGE 中3條Fe 2S OD 帶上移已與第三條CuZn 2S OD 相重疊, Mn 2S OD 帶已能基本分清. 同時(shí)可見在715%和10%的P AGE 中還存在CuZn 2S OD 抑制不完全的現(xiàn)象, 經(jīng)KCN 和H 2O 2處理后在負(fù)極處的一些譜帶性質(zhì)也很難判斷; 在4%35%的梯度膠中3種類型S OD 譜帶完全分離, Fe 2S OD 帶上移至Mn 2S OD 和CuZn 2S OD 間, 與純化的Fe 2S OD 有相同的R f 值. 香

23、櫞S OD 在10%的P AGE 中, 有1條對(duì)KCN 和H 2O 2都敏感的CuZn 2S OD 譜帶, 它的R f 值最小,Mn 2S OD 和Fe 2S OD 即使以抑制劑處理, 無(wú)法判斷. 在4%35%的梯度膠中3種S OD 條為Mn 2S OD , R f 值較大的2條為CuZn 2S OD, R f 值位于兩者之間的為可見, 枸杞和香櫞的3種S OD , , 如香櫞CuZn 2S OD 的R f 3D , R f 值最大(圖3A , 在朱桔中R f 值卻最小(圖 H 2O 2S 類型時(shí), 常有抑制不完全的現(xiàn)象, 有的因譜帶重疊, 即使采用, Fe 2S OD 、Mn 2S OD (

24、圖3D 和朱桔的Mn 2S OD 、CuZn 2S OD (圖5A . 但在4%35%梯度膠上, 如存在Fe 2S OD 時(shí), 其R f 值總是位于Mn 2S OD 和CuZn 2S OD 之間, 枸杞、香櫞和朱桔3種類型S OD 在梯度膠上均有此規(guī)律可尋. 在梯度膠中以其R f 值大小判斷S OD 的類型的結(jié)果與用抑制劑處理的結(jié)果完全一致, 利用這一特點(diǎn)我們發(fā)現(xiàn)了許多高等植物含有Fe 2S OD 4, 9, 14 .214S DS 處理對(duì)在GPGE 和P AGE 中S OD 類型鑒定的影響樣品經(jīng)1%S DS 處理后, 以相同量分別進(jìn)行GPGE 和P AGE, 結(jié)果見圖4. 在梯度膠中, 7種

25、植物在A 區(qū)的S OD 譜帶活性都被S DS 抑制, 無(wú)一例外, 表明它們都是Mn 2S OD; C 區(qū)的S OD 譜帶對(duì)S DS 不敏感, 為CuZn 2S OD, 其中金蕎麥和還亮草都含有1條對(duì)S DS 敏感的譜帶, 但它們經(jīng)KCN 和H 2O 2處理譜帶消失, 具有CuZn 2S OD 的典型特征, 這些譜帶的R f 值在經(jīng)S DS 處理前后一致. B 區(qū)帶中被S DS 抑制的為Fe 2S OD , 其中代代花和南苜蓿的Fe 2S OD 的含量大于30%, 金蕎麥、馬兜鈴、無(wú)花果、三葉草都含有對(duì)S DS 敏感的Fe 2S OD (結(jié)果待發(fā)表 . 經(jīng)S DS 處理后留存的為CuZn 2S

26、OD, 而Mn 2S OD 和Fe 2S OD 譜帶消失, Mn 2S OD 和Fe 2S OD 的區(qū)分則可根據(jù)它們?cè)贕PGE 圖譜上的R f 值確定. 由此可見, GPGE 結(jié)合S DS 處理是S OD 類型鑒定的有效途徑之一.在P AGE 圖譜上經(jīng)S DS 處理后, 有的譜帶活性基本不變, 如2、6和12, 有的出現(xiàn)了一些新譜帶, 如3、001南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 第31卷第4期(2008年7、9、13、15, 可能是CuZn 2S OD 與Mn 2S OD 、Fe 2S OD 重疊所致或是經(jīng)S DS 處理改變了S OD 電荷性質(zhì). 番茄在梯度膠B 區(qū)有2條對(duì)S DS 敏感的S OD

27、譜帶(圖4中17 , 證實(shí)了它存在Fe 2S OD 15, 但在P AGE 上經(jīng)S DS 處理后未發(fā)現(xiàn)Fe 2S OD, 顯然在P AGE 中經(jīng)S DS 處理不適合于植物粗提液中S OD 類型判定 . 215S OD 結(jié)果見圖(圖5C 中的a 、b 帶對(duì)應(yīng)于GPGE 圖譜上的a 、b 帶(圖5B 和P AGE 圖譜上的a 、b 帶(圖5A , 分別為Mn 2S OD 和Fe 2S OD , 但在P AGE圖譜上a 帶R f 值大于b 帶; c 帶有2條為CuZn 2S OD , 在二次電泳和梯度膠中是相互對(duì)應(yīng), 但在P AGE 圖譜上a 、c 帶混雜, 從純化的Mn 2S OD 和CuZn 2

28、S OD 的P AGE 圖譜上可看出a 、c 是重疊帶9. 在二次電泳中新、老葉中Fe 2S OD 活性都約占S OD 總活性的30%, 與GPGE 中的結(jié)果相當(dāng), 但在P AGE 中老葉這一比例約30%, 新葉低于5%.從二次電泳中S OD 譜帶在P AGE 和GPGE 中的對(duì)應(yīng)關(guān)系可看出, 朱桔3種S OD 類型在GPGE 中能按照分子大小有效地分離和鑒別, 但在P AGE 中S OD 譜帶有重疊現(xiàn)象, 分離不徹底, 新葉中的植物次生物質(zhì)干擾了S OD 活性顯示, 甚至無(wú)譜帶.3討論目前國(guó)內(nèi)外在S OD 同工酶的分離和鑒定研究中都是采用10%左右的P AGE, 但分離效果和圖譜都不很理想.

29、 我們?cè)阼坭焦麑?shí)S OD 研究中采用了GPGE, 并首次報(bào)道了枸杞含有Fe 2S OD4, 在隨后的研究中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了何首烏、香櫞等十幾種高等植物存在Fe 2S OD14. 迄今為止國(guó)內(nèi)外報(bào)道含F(xiàn)e 2S OD 的高等植物僅番茄、銀杏、睡蓮、蕓苔、樟樹等十幾種10, 15219, S OD 同工酶的分離也都是采用P AGE, 我們的發(fā)現(xiàn)與用GPGE 替代P AGE 研究S OD 電泳技術(shù)改進(jìn)密切相關(guān), 但對(duì)GPGE 分離和鑒定S OD 類型和S OD 譜帶在GPGE 與P AGE 中相互對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道, 本文對(duì)此進(jìn)行了初步探討.311GPGE 比P AGE 能更有效地分離和鑒定S

30、 OD 同工酶類型本研究表明, 在GPGE 圖譜上的S OD 譜帶可明顯分為A 、B 、C 3個(gè)區(qū), A 區(qū)R f 值最小, 對(duì)S DS 敏感, 為分子量最大的Mn 2S OD; C 區(qū)R f 值最大, 對(duì)S DS 不敏感, 為相對(duì)分子質(zhì)量較小的CuZn 2S OD; B 區(qū)的譜帶R f 值位于二者之間, 經(jīng)S DS 處理后消失, 為Fe 2S OD. 由于GPGE 是根據(jù)孔徑大小分離酶和蛋白質(zhì), 其R f 值與101程光宇, 等:聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳和均一凝膠電泳在分離及鑒定植物S OD 同工酶中的比較研究南京師大學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 31 卷第 4 期 (2008 年 第 SOD 分子大小

31、有相關(guān)性 8 和 M n 2SOD、 2SOD 區(qū)分開 ,由于 Fe 2SOD 的 R f 值通常位于 M n 2SOD 和 CuZn 2SOD 間 ,故可確定 SOD 類型 . Fe 本文中枸杞 、 、 朱桔 香櫞存在的 3 種 SOD 類型符合這一規(guī)律 ,當(dāng)采用 KCN 和 H2 O2 對(duì)枸杞 、 香櫞 、 金蕎麥和 還亮草等 SOD 類型進(jìn)行鑒定時(shí) ,結(jié)果與 GPGE 中各譜帶 R f 值與 SDS處理相結(jié)合來(lái)確定酶類型的結(jié)果一 致 ,說明了將 GPGE 中各譜帶 R f 值與 SDS處理的結(jié)果相結(jié)合是分離和鑒定 SOD 類型的一種簡(jiǎn)便有效的 新方法 . 在傳統(tǒng)的 PAGE 中 SOD

32、譜帶受其所帶電荷 、 分子大小 、 膠濃度等多種因素影響 ,分離的 R f 值變化 本文對(duì) GPGE 和 PAGE 檢測(cè) SOD 的靈敏度和分辨率進(jìn)行了比較 , 結(jié)果表明 , PAGE 檢測(cè)牛血 SOD 靈 - 13 - 15 敏度為 10 mol, GPGE 檢測(cè)牛血 SOD 靈敏度可達(dá) 10 mol 由于 GPGE 的靈敏度比 PAGE 高 2 個(gè)數(shù)量 . 級(jí) ,可檢測(cè)到在 PAGE 圖譜上因含量很低難以顯示或活性低于 5%的 Fe 2SOD 譜帶 (如馬兜鈴 、 無(wú)花果 三 葉草等 ,它們的 R f 值都位于 M n 2SOD 和 CuZn 2SOD 的 B 區(qū)之間 . 在 GPGE 圖

33、譜中 SOD 譜帶清晰 ,點(diǎn)樣量 適中時(shí)為扁平形 ,邊緣明顯 ,有較高的分辨率 , 牛血 SOD 可清晰辨認(rèn)出 4 條帶 , 番茄和朱桔粗酶液可分辨 出 4 5 條帶 ,在 PAGE 圖譜中因干擾的存在大大影響了譜帶的分辨 ,它們的譜帶較模糊只有 2 3 條 . 純 化的枸杞 Fe 2SOD 在 GPGE 和 PAGE 中都有 3 條帶 ,但前者的靈敏度和分辨率明顯高于后者 . 高的靈敏度 和分辨率使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確可靠 ,可見 , GPGE 分離 SOD 特別是 Fe 2SOD 是比 PAGE 更好的方法 . 313 GPGE 分離和鑒定 SOD 的可靠性 本文發(fā)現(xiàn)在 C 區(qū)對(duì) SDS敏感的譜

34、帶 (金蕎麥和還亮草 也能被 KCN 和 H2 O2 抑制為 CuZn 2SOD ,說明 了以 R f 值來(lái)判斷 SOD 類型是可靠的 . 植物材料中的次生物質(zhì)豐富 ,它們會(huì)與 SOD 結(jié)合影響酶顯示 ,朱 桔 Fe 2SOD (新葉 和何首烏 M n 2SOD (圖片未列出 在 PAGE 中幾乎無(wú)帶 ,在 GPGE 中含量都達(dá) 30%左右 , 與二次電泳結(jié)果一致 ,提示在 GPGE 中經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間電泳后干擾物可能與 SOD 分離泳出凝膠 ,能真實(shí)反映出 全部 SOD 譜帶 ,而 PAGE 會(huì)造成一些 SOD 的漏檢 . SOD 譜帶在 GPGE 和 PAGE 中對(duì)應(yīng)關(guān)系由二次電泳反 映出來(lái) ,

35、GPGE 中的 SOD 譜帶通過二次電泳都能和 PAGE 的相互對(duì)應(yīng) , 說明了 GPGE 分離和鑒定 SOD 的 結(jié)果是可靠的 ,但 PAGE 中 3 種 SOD 類型的 R f 值變化很大 ,與酶類型間無(wú)相關(guān)性 ,同時(shí) ,通過二次電泳還 可以看出 , GPGE 對(duì)在 PAGE 上重疊和有干擾的 SOD 譜帶的分離和鑒定是有效的 . 會(huì)更好地反映出同工酶間的差異 ,可見 ,將 GPGE 和 PAGE 相結(jié)合研究植物 SOD 同工酶是更科學(xué)的方法 . 參考文獻(xiàn) 3 羅廣華 ,王愛國(guó) . 植物 SOD 的凝膠電泳及活性顯示 J . 植物生理學(xué)通訊 , 1983 (6 : 44 2 45. 85.

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37、CN 和 H2 O2 等抑制劑 ,由于 KCN 為劇毒品 ,使 SOD 類型的研究受到了限制 , 當(dāng)酶帶相互重疊時(shí)甚至無(wú)法有結(jié)果 (如香櫞 、 朱桔等 . 可見 , 在 SOD 分離和類型鑒定方面 GPGE 比 PAGE 有更大的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景 . 312 GPGE 分離 SOD 的靈敏度和分辨率 GPGE 在分離和鑒定 SOD 方面有諸多優(yōu)勢(shì) ,但對(duì)研究帶有不同電荷的同一類型 SOD 同工酶 ,則 PAGE 1 In 2Kwon Kim , Yang2In Yim , Young M in 2Kim , et al CbiX 2homologous p rotein ( CbiXhp , a

38、 metal2binding p rotein, from . 5 王亦根 ,程光宇 ,吳國(guó)榮 ,等 . 牛血紅細(xì)胞銅鋅超氧物歧化酶的純化及性質(zhì) J . 南京師大學(xué)報(bào) : 自然科學(xué)版 , 1994, 17 ( 2 : 108 2 112. 2 Yao C L , W ang A L , W ang Z Y, et al Purification and partial characterization of Cu, Zn superoxide dis . mutase from haemo2 lymph of oriental river p rawn macrobrachium nippon

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