生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課件-(淀粉酶活力測定)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-生物技術(shù)系生物技術(shù)系 2017.5 Henan University of Technology實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.淀粉含量測定淀粉含量測定2.氨基酸的紙上層析氨基酸的紙上層析3.蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量測定4.淀粉酶活力測定淀粉酶活力測定 5.蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定6.甲醛滴定測氨基氮甲醛滴定測氨基氮 7.酵母酵母RNA的提取、組分鑒定和含量測定的提取、組分鑒定和含量測定8. 賴氨酸含量測定賴氨酸含量測定9. 凝膠層析法分離蛋白質(zhì)凝膠層析法分離蛋白質(zhì)10. 蔗糖酶的提取與部分純化蔗糖酶的提取與部分純化11. 蔗糖酶活力的測定蔗糖酶活力的測定12. Brad

2、ford法測定蛋白質(zhì)含量法測定蛋白質(zhì)含量教學(xué)目的教學(xué)目的 生物化學(xué)是專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課，其先修課程生物化學(xué)是專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課，其先修課程為無機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)和有機(jī)化學(xué)為無機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)和有機(jī)化學(xué) 。其目的。其目的是：學(xué)習(xí)和掌握生物技術(shù)，培養(yǎng)動(dòng)手觀察和思是：學(xué)習(xí)和掌握生物技術(shù)，培養(yǎng)動(dòng)手觀察和思維能力。維能力。學(xué)習(xí)方法學(xué)習(xí)方法1 1、預(yù)習(xí)：實(shí)驗(yàn)前必須進(jìn)行充分的預(yù)習(xí)和準(zhǔn)備，并寫出預(yù)習(xí)報(bào)告，做到心中、預(yù)習(xí)：實(shí)驗(yàn)前必須進(jìn)行充分的預(yù)習(xí)和準(zhǔn)備，并寫出預(yù)習(xí)報(bào)告，做到心中有數(shù)，這是做好實(shí)驗(yàn)的前提。有數(shù)，這是做好實(shí)驗(yàn)的前提。2 2、操作：應(yīng)按擬定的實(shí)驗(yàn)操作計(jì)劃與方案進(jìn)行。做到輕（動(dòng)作輕、講話、操作：應(yīng)按擬定的實(shí)驗(yàn)操作

3、計(jì)劃與方案進(jìn)行。做到輕（動(dòng)作輕、講話輕），細(xì)（細(xì)心觀察、細(xì)致操作），準(zhǔn)（試劑用量準(zhǔn)確、結(jié)果及其記錄輕），細(xì)（細(xì)心觀察、細(xì)致操作），準(zhǔn)（試劑用量準(zhǔn)確、結(jié)果及其記錄準(zhǔn)確），潔（使用的儀器清潔，實(shí)驗(yàn)桌面整潔，實(shí)驗(yàn)結(jié)束把實(shí)驗(yàn)室打掃準(zhǔn)確），潔（使用的儀器清潔，實(shí)驗(yàn)桌面整潔，實(shí)驗(yàn)結(jié)束把實(shí)驗(yàn)室打掃清潔）。清潔）。3 3、在實(shí)驗(yàn)全過程中，應(yīng)集中注意力，獨(dú)立思考解決問題。自己難以解釋時(shí)、在實(shí)驗(yàn)全過程中，應(yīng)集中注意力，獨(dú)立思考解決問題。自己難以解釋時(shí)可請老師解答?？烧埨蠋熃獯稹? 4、寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告：做完實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并作出結(jié)論，或根據(jù)實(shí)驗(yàn)、寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告：做完實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并作出結(jié)論，或根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

4、進(jìn)行計(jì)算和處理。主要包括：數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和處理。主要包括：a a、目的，、目的，b b、原理，、原理，c c、操作步驟及、操作步驟及實(shí)驗(yàn)性質(zhì)、現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)性質(zhì)、現(xiàn)象，d d、數(shù)據(jù)處理（含誤差原因及分析），、數(shù)據(jù)處理（含誤差原因及分析），e e、討論，、討論，f f、思考題回答。思考題回答。實(shí)驗(yàn)室守則實(shí)驗(yàn)室守則生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室守則是學(xué)生實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行的保證，學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須遵守生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室守則是學(xué)生實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行的保證，學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須遵守以下規(guī)則：以下規(guī)則：1. 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，須遵守實(shí)驗(yàn)室紀(jì)律和制度，聽從老師指導(dǎo)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，須遵守實(shí)驗(yàn)室紀(jì)律和制度，聽從老師指導(dǎo) 2. 未穿實(shí)驗(yàn)服、未寫實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告者不

5、得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。未穿實(shí)驗(yàn)服、未寫實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告者不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3. 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，要熟悉周圍環(huán)境，熟悉防火及急救設(shè)備器材的使用方法和存放位置，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，要熟悉周圍環(huán)境，熟悉防火及急救設(shè)備器材的使用方法和存放位置，遵守安全規(guī)則。遵守安全規(guī)則。 4. 實(shí)驗(yàn)前，清點(diǎn)、檢查儀器、明確儀器規(guī)范操作方法及注意事項(xiàng)，否則不得動(dòng)手操作。實(shí)驗(yàn)前，清點(diǎn)、檢查儀器、明確儀器規(guī)范操作方法及注意事項(xiàng)，否則不得動(dòng)手操作。 5. 使用藥品時(shí)，要求明確其性質(zhì)及使用方法后，據(jù)實(shí)驗(yàn)要求規(guī)范使用。禁止使用不明確使用藥品時(shí)，要求明確其性質(zhì)及使用方法后，據(jù)實(shí)驗(yàn)要求規(guī)范使用。禁止使用不明確藥品或隨意混合藥品。藥品或隨意

6、混合藥品。6. 實(shí)驗(yàn)中，保持安靜，認(rèn)真操作，仔細(xì)觀察，積極思維，實(shí)驗(yàn)過程中必須有原始記錄，實(shí)驗(yàn)中，保持安靜，認(rèn)真操作，仔細(xì)觀察，積極思維，實(shí)驗(yàn)過程中必須有原始記錄，不得擅自離開崗位。不得擅自離開崗位。7. 實(shí)驗(yàn)室公用物品（包括器材、藥品等）用完后，應(yīng)歸放回原指定位置。實(shí)驗(yàn)廢液、廢實(shí)驗(yàn)室公用物品（包括器材、藥品等）用完后，應(yīng)歸放回原指定位置。實(shí)驗(yàn)廢液、廢物按要求放入指定收集器皿。物按要求放入指定收集器皿。8. 愛護(hù)公物，注意衛(wèi)生，保持整潔，節(jié)約用水、電、氣及器材。愛護(hù)公物，注意衛(wèi)生，保持整潔，節(jié)約用水、電、氣及器材。9. 實(shí)驗(yàn)完畢后，要求整理、清潔實(shí)驗(yàn)臺面，檢查水、電、氣源，打掃實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)

7、完畢后，要求整理、清潔實(shí)驗(yàn)臺面，檢查水、電、氣源，打掃實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生。 10. 實(shí)驗(yàn)記錄經(jīng)教師簽名認(rèn)可后，方可離開實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)記錄經(jīng)教師簽名認(rèn)可后，方可離開實(shí)驗(yàn)室。 實(shí)驗(yàn)一淀粉含量測定實(shí)驗(yàn)一淀粉含量測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握旋光儀的操作使用。掌握旋光儀的操作使用。 2.了解旋光法測粗淀粉的基本原理。了解旋光法測粗淀粉的基本原理。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 在加熱及稀鹽酸的作用下，淀粉水解并轉(zhuǎn)入鹽酸溶在加熱及稀鹽酸的作用下，淀粉水解并轉(zhuǎn)入鹽酸溶液中。在一定的水解條件下，不同谷物淀粉的比旋液中。在一定的水解條件下，不同谷物淀粉的比旋光度是不同的。其在光度是不同的。其在171195之間，因此可用

8、旋之間，因此可用旋光法測定粗淀粉的含量。光法測定粗淀粉的含量。三、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1、主要儀器：、主要儀器：（1）旋光儀）旋光儀（2）電子天平（感量）電子天平（感量0.0001g）2、試劑：、試劑： 1鹽酸溶液鹽酸溶液 30硫酸鋅溶液。硫酸鋅溶液。 15亞鐵氰化鉀溶液。亞鐵氰化鉀溶液。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品的處理樣品的處理 在電子天平上稱取小麥粉在電子天平上稱取小麥粉2.5000g置于三角瓶中置于三角瓶中加入加入50ml 1%HCl混成漿狀（不能有結(jié)塊）混成漿狀（不能有結(jié)塊）沸水浴中準(zhǔn)確加沸水浴中準(zhǔn)確加熱熱15min先加先加1ml 30% ZnSO4混勻混勻再加再加1

9、ml 15%亞亞鐵氰化鉀混勻鐵氰化鉀混勻移至移至100ml容量瓶中加水定容混勻后過濾容量瓶中加水定容混勻后過濾棄去最初棄去最初15ml收集其余濾液。收集其余濾液。2.旋光度測定旋光度測定 取濾液取濾液20ml置于旋光管中，先用置于旋光管中，先用1%HCl 調(diào)節(jié)旋光儀調(diào)節(jié)旋光儀“0”點(diǎn)，然后將樣品溶液放入旋光儀中測點(diǎn)，然后將樣品溶液放入旋光儀中測六、思考題六、思考題樣品加鹽酸處理時(shí)，煮沸時(shí)間少于或多于樣品加鹽酸處理時(shí)，煮沸時(shí)間少于或多于15min會對測定會對測定結(jié)果產(chǎn)生什么影響？結(jié)果產(chǎn)生什么影響？ 五五 、 結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算 100.10020WLD淀粉含量（） ）：樣品質(zhì)量（gdm27 .18

10、220WLD其中其中：實(shí)驗(yàn)二氨基酸的紙上層析實(shí)驗(yàn)二氨基酸的紙上層析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?通過對氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方通過對氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法。法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上的紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上的OH具有親水性，因此能吸附一層水作為固定相，而通常具有親水性，因此能吸附一層水作為固定相，而通常把有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。有機(jī)溶劑自上而下流動(dòng)，稱為下行把有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。有機(jī)溶劑自上而下流動(dòng)，稱為下行層析；自下而上流動(dòng)，稱為上行層析。流動(dòng)相流經(jīng)支持物時(shí)層析；自下而上流動(dòng)

11、，稱為上行層析。流動(dòng)相流經(jīng)支持物時(shí)與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相之間不斷分配而得到與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相之間不斷分配而得到分離。分離。三、儀器和試劑三、儀器和試劑1、主要儀器：、主要儀器：（1）層析缸）層析缸（2）微量進(jìn)樣器）微量進(jìn)樣器（3）噴霧器）噴霧器2、試劑、試劑 ：（1）展開劑：乙醇：水：冰乙酸）展開劑：乙醇：水：冰乙酸50:10:1 （2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：0.5%的賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸溶的賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸溶液及它們的混合液液及它們的混合液 （3）顯色劑：）顯色劑：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。水合茚三酮丙酮溶液。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1、平衡：將

12、展開劑（乙醇：水：冰乙酸、平衡：將展開劑（乙醇：水：冰乙酸50:10:1）放入培養(yǎng)）放入培養(yǎng) 皿中置于密閉容器內(nèi)使其充皿中置于密閉容器內(nèi)使其充滿展開劑（滿展開劑（24h左右）左右）2、點(diǎn)樣：取濾紙、點(diǎn)樣：取濾紙1張用鉛筆在距下方張用鉛筆在距下方2cm處劃線并將所得線段分成處劃線并將所得線段分成5等分從而得到等分從而得到4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，用個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，用微量進(jìn)樣器分別取微量進(jìn)樣器分別取5l下列樣品下列樣品phelyspro混合混合Aa向向4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)上加樣（樣品擴(kuò)散中個(gè)標(biāo)記點(diǎn)上加樣（樣品擴(kuò)散中1cm）3、展層：將濾紙卷成筒狀且不能夠重疊，并用棉線扎緊然后垂直放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行展層、展層：將濾紙卷成筒狀且不能

13、夠重疊，并用棉線扎緊然后垂直放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行展層2h（當(dāng)（當(dāng)展開劑沿到達(dá)濾紙長度三分之二時(shí)，即可取出）測量展開劑前沿移動(dòng)距離（展開劑沿到達(dá)濾紙長度三分之二時(shí)，即可取出）測量展開劑前沿移動(dòng)距離（a）4、顯色：用、顯色：用0.1%茚三酮茚三酮-丙酮溶液朝點(diǎn)樣面噴霧（不要噴得太多）然后將濾紙置于電爐上方丙酮溶液朝點(diǎn)樣面噴霧（不要噴得太多）然后將濾紙置于電爐上方20cm處加熱直至斑點(diǎn)出現(xiàn)為止，測量各斑點(diǎn)中心到點(diǎn)樣點(diǎn)距離（處加熱直至斑點(diǎn)出現(xiàn)為止，測量各斑點(diǎn)中心到點(diǎn)樣點(diǎn)距離（b）1計(jì)算出各種氨基酸的計(jì)算出各種氨基酸的Rf值，并根據(jù)值，并根據(jù)Rf值鑒定出混值鑒定出混合氨基酸中的各組分，在層析圖譜上標(biāo)出各氨基

14、酸合氨基酸中的各組分，在層析圖譜上標(biāo)出各氨基酸名稱。名稱。2對氨基酸移動(dòng)快慢的原因給予簡要分析。對氨基酸移動(dòng)快慢的原因給予簡要分析。五、結(jié)果計(jì)算五、結(jié)果計(jì)算六、思考題六、思考題）展開劑前沿移動(dòng)距離（）（斑點(diǎn)中心到點(diǎn)樣點(diǎn)距離abR f實(shí)驗(yàn)三蛋白質(zhì)分子量測定實(shí)驗(yàn)三蛋白質(zhì)分子量測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握電泳基本原理、分類、影響因素掌握電泳基本原理、分類、影響因素, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳用途用途,凝膠制備凝膠制備。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的方法，主要是酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的方法，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大

15、小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差別。所造成的電泳遷移率的差別。 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），使所有蛋白質(zhì)顆粒表面覆蓋一），使所有蛋白質(zhì)顆粒表面覆蓋一層層SDS分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異消失，此時(shí)，蛋分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異消失，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在分子量間時(shí)，電泳遷移率與分子量的

16、對數(shù)呈之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈直線關(guān)系。直線關(guān)系。三、儀器和試劑三、儀器和試劑1主要儀器主要儀器（1）電泳儀）電泳儀（2）電泳槽）電泳槽2. 試劑試劑（1）電極緩沖液）電極緩沖液（2） PH 7.2 凝膠緩沖液凝膠緩沖液（3）1%TEMED，（4）30%凝膠儲液，凝膠儲液，（5）10%過硫酸銨過硫酸銨（6）0.1%考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色液（4）10%乙酸脫色液乙酸脫色液四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 電泳槽的安裝：取兩塊玻璃板電泳槽的安裝：取兩塊玻璃板將帶玻璃條的板（高板）放置桌面上將帶玻璃條的板（高板）放置桌面上在上面放在上面放置置“U”型橡膠條型橡膠條最后將凹槽玻璃

17、板（低板）壓在高板上，置于電泳槽內(nèi)，用最后將凹槽玻璃板（低板）壓在高板上，置于電泳槽內(nèi)，用鍥子壓緊。鍥子壓緊。2. 凝膠液的制備與灌裝：配置凝膠液的制備與灌裝：配置20ml凝膠液：在小燒杯中依次加入凝膠液：在小燒杯中依次加入5ml 30%凝膠儲液，凝膠儲液，10ml PH 7.2 凝膠緩沖液，凝膠緩沖液，2ml 1%TEMED，2.2ml重蒸水，重蒸水，0.8ml 10%過硫酸過硫酸銨混勻銨混勻立即沿高板內(nèi)側(cè)倒凝膠液于兩板之間直至低板上沿立即沿高板內(nèi)側(cè)倒凝膠液于兩板之間直至低板上沿插上梳子放置插上梳子放置15min，待膠凝后取下，待膠凝后取下“U”條條重新將膠板放置于電泳槽內(nèi)重新將膠板放置于電

18、泳槽內(nèi)向外槽內(nèi)加三分向外槽內(nèi)加三分之一槽深電極緩沖液之一槽深電極緩沖液向內(nèi)槽加入電極緩沖液沒過低板向內(nèi)槽加入電極緩沖液沒過低板最后拔出梳子。最后拔出梳子。3. 加樣：用微量進(jìn)樣器加入加樣：用微量進(jìn)樣器加入7l標(biāo)準(zhǔn)蛋白于中間膠槽內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)蛋白于中間膠槽內(nèi)其余槽內(nèi)加入其余槽內(nèi)加入7l下列樣品下列樣品牛血清蛋白綠豆分離蛋白牛血清蛋白綠豆分離蛋白4. 電泳：連接電極線，高板外側(cè)接正極，低板內(nèi)側(cè)槽接負(fù)極，打開電源電泳：連接電極線，高板外側(cè)接正極，低板內(nèi)側(cè)槽接負(fù)極，打開電源調(diào)電流調(diào)電流120mA電泳電泳2h（當(dāng)指示劑前沿超過二分之一膠長時(shí)停止）（當(dāng)指示劑前沿超過二分之一膠長時(shí)停止）5. 剝膠：取下膠板倒去電極

19、緩沖液剝膠：取下膠板倒去電極緩沖液量取指示劑遷移距離和染色劑的前膠長，然后量取指示劑遷移距離和染色劑的前膠長，然后將膠板置于水龍頭下方?jīng)_玻板四周直至膠與玻璃板分離將膠板置于水龍頭下方?jīng)_玻板四周直至膠與玻璃板分離6. 染色與固定：將膠板放入染色盒內(nèi)染色與固定：將膠板放入染色盒內(nèi)向其中加入向其中加入0.1%考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250使其浸沒使其浸沒置于搖床上染色過夜置于搖床上染色過夜7. 脫色：用脫色：用10%乙酸溶液脫色至譜帶清晰，測定脫色后膠長及各譜帶遷移距離。乙酸溶液脫色至譜帶清晰，測定脫色后膠長及各譜帶遷移距離。五五 、 結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算1、計(jì)算相對遷移率：、計(jì)算相對遷移率：2、以相對遷

20、移率、以相對遷移率MR為橫坐標(biāo)、為橫坐標(biāo)、LgMr為縱坐標(biāo)，作出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲為縱坐標(biāo)，作出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。線。3、求分子量、求分子量距離距離脫色后膠長染色前膠長）（遷移指示 劑示劑遷移蛋白 質(zhì)白質(zhì)遷移MR率相對五、注意事項(xiàng)五、注意事項(xiàng)130%Acr-Bis是神經(jīng)毒化合物，操作時(shí)要小心，做好個(gè)是神經(jīng)毒化合物，操作時(shí)要小心，做好個(gè)人防護(hù)人防護(hù)2過硫酸銨需現(xiàn)用現(xiàn)配過硫酸銨需現(xiàn)用現(xiàn)配3過硫酸銨和過硫酸銨和TEMED在灌膠前加入即可在灌膠前加入即可4用微量加樣器上樣時(shí)，勿刺破膠面用微量加樣器上樣時(shí)，勿刺破膠面 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所學(xué)知識，自行設(shè)計(jì)豌豆凝集素的分離純化實(shí)驗(yàn)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所學(xué)知識，自行設(shè)計(jì)豌豆凝集素的

21、分離純化實(shí)驗(yàn)。六、思考題六、思考題實(shí)驗(yàn)四淀粉酶活力測定實(shí)驗(yàn)四淀粉酶活力測定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握測定淀粉酶（包括學(xué)習(xí)和掌握測定淀粉酶（包括-淀粉酶和淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理淀粉酶）活力的原理和方法。和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 淀粉酶主要包括淀粉酶主要包括-淀粉酶和淀粉酶和-淀粉酶兩種。淀粉酶兩種。-淀粉酶可作用于淀淀粉酶可作用于淀粉中的粉中的-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，還原糖，-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解，生成麥芽淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解，生成麥芽糖。淀粉酶催化產(chǎn)生的這

22、些還原糖能使糖。淀粉酶催化產(chǎn)生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的生成棕紅色的3-氨基氨基-5-硝基水楊酸。硝基水楊酸。其反應(yīng)如右圖其反應(yīng)如右圖：淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。的量表示酶活力。淀粉酶存在于萌發(fā)后的禾谷類種子中，其中主要是淀粉酶存在于萌

23、發(fā)后的禾谷類種子中，其中主要是-淀粉酶和淀粉酶和-淀粉酶。兩種淀粉酶特性不淀粉酶。兩種淀粉酶特性不同，同，-淀粉酶不耐酸，在淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。以下迅速鈍化。-淀粉酶不耐熱，在淀粉酶不耐熱，在7015min鈍化。根據(jù)它們鈍化。根據(jù)它們的這種特性，采用加熱的方法鈍化的這種特性，采用加熱的方法鈍化-淀粉酶，測出淀粉酶，測出-淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測定淀粉淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測定淀粉酶總活力（酶總活力（-淀粉酶活力淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再減去淀粉酶活力），再減去-淀粉酶的活力，就可求出淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。淀粉酶的活力。三、儀器和試劑三、儀器和

24、試劑 主要儀器：主要儀器： （1）離心機(jī)）離心機(jī) （2）分光光度計(jì)）分光光度計(jì) 試劑試劑 （1）標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（）標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（2mg/mL） （2）1%3,5-二硝基水楊酸試劑二硝基水楊酸試劑 （3）1%淀粉淀粉四、操作步驟四、操作步驟以麥芽糖含量（以麥芽糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。）為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（每標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（每2組組4人做人做1標(biāo)準(zhǔn)曲線）標(biāo)準(zhǔn)曲線） 2. 淀粉酶液的制備：淀粉酶液的制備： 在電子天平上稱取小麥芽（在在電子天平上稱取小麥芽（在9428冰箱內(nèi)，用后放回）冰箱內(nèi)，用后放回）0.5g置于研缽中加置于研缽中

25、加20ml水研成漿狀水研成漿狀轉(zhuǎn)移至離心管中轉(zhuǎn)移至離心管中2000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分離心分離心5min（注意離心前對稱放置的離心管應(yīng)在天平上平衡）（注意離心前對稱放置的離心管應(yīng)在天平上平衡）取上清液于取上清液于100ml容量瓶中加水定容混容量瓶中加水定容混勻勻即得淀粉酶原液即得淀粉酶原液用于用于-淀粉酶活力測定淀粉酶活力測定 吸取原液吸取原液5ml于于100ml容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀釋液容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀釋液用于總酶活力測定。用于總酶活力測定。3. 淀粉酶活力測定淀粉酶活力測定 -淀粉酶活力測定淀粉酶活力測定 吸取原液吸取原液1ml于具塞試管中于具塞試管中70保溫保溫15min用于鈍化用

26、于鈍化-淀粉酶淀粉酶加加1ml 1%淀粉置于淀粉置于40水浴中保溫水浴中保溫5min加加1% 3.5一二硝基水楊酸一二硝基水楊酸2ml 沸水加熱沸水加熱5min后加水至后加水至20ml混勻測混勻測A1（用（用1#管調(diào)零）管調(diào)零） 總酶活力測定總酶活力測定 吸取稀釋液吸取稀釋液1ml于具塞試管中于具塞試管中加加1ml 1%淀粉淀粉40保存保存5min加入加入1% 3.5一二硝基水楊酸一二硝基水楊酸2ml沸水加熱沸水加熱5min后后加水至加水至20ml混勻測混勻測A2（用（用1#管調(diào)零）管調(diào)零）五、結(jié)果計(jì)算五、結(jié)果計(jì)算-淀粉酶活力（淀粉酶活力（）淀粉酶總活力）淀粉酶總活力-淀粉酶活力淀粉酶活力麥芽

27、糖含量從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得麥芽糖含量從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得麥芽糖的毫克數(shù)麥芽糖的毫克數(shù)原液體積為原液體積為100稀釋倍數(shù)為稀釋倍數(shù)為20規(guī)定：規(guī)定：40度度5分鐘內(nèi)淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生分鐘內(nèi)淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生1mg麥芽糖為麥芽糖為1個(gè)活力單位（個(gè)活力單位（u）六、附六、附 注注1樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的大小而定。大小而定。2為了確保酶促反應(yīng)時(shí)間的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行保溫這一步驟時(shí)，可以為了確保酶促反應(yīng)時(shí)間的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行保溫這一步驟時(shí)，可以將各試管每隔一定時(shí)間依次放入恒溫水浴，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，到達(dá)將各試管每隔一定時(shí)間依次放入恒

28、溫水浴，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，到達(dá)5min時(shí)取出試管，立即加入時(shí)取出試管，立即加入3,5-二硝基水楊酸以終止酶反應(yīng)，以便盡量減二硝基水楊酸以終止酶反應(yīng)，以便盡量減小因各試管保溫時(shí)間不同而引起的誤差。同時(shí)恒溫水浴溫度變化應(yīng)不小因各試管保溫時(shí)間不同而引起的誤差。同時(shí)恒溫水浴溫度變化應(yīng)不超過超過0.5。3如果條件允許，各實(shí)驗(yàn)小組可采用不同材料，例如萌發(fā)如果條件允許，各實(shí)驗(yàn)小組可采用不同材料，例如萌發(fā)1d、2d、3d、4d的小麥種子，比較測定結(jié)果，以了解萌發(fā)過程中這兩種淀粉酶的小麥種子，比較測定結(jié)果，以了解萌發(fā)過程中這兩種淀粉酶活性的變化?；钚缘淖兓Ｆ摺⑺伎碱}七、思考題1為什么要將試管中的淀粉酶原液置為什么

29、要將試管中的淀粉酶原液置70水浴中保溫水浴中保溫15min？2為什么要將各試管中的淀粉酶原液和為什么要將各試管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分別置于淀粉溶液分別置于40水浴中保水浴中保溫？溫？實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)含量的測定實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)含量的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。學(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 含氮的有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧含氮的有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨?；己退?，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。 濃堿可使消化液中的硫

30、酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定濃度的過量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氫離子濃度蒸餾到一定濃度的過量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氫離子濃度降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定，直到恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止，降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定，直到恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)（相當(dāng)于待測物中氨的摩爾數(shù)）計(jì)算出待最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)（相當(dāng)于待測物中氨的摩爾數(shù)）計(jì)算出待測物中的總氮量。測物中的總氮量。三、實(shí)驗(yàn)試劑、器材三、實(shí)驗(yàn)試劑、器材1主要儀器主要儀器 (1)凱氏定氮蒸餾裝置凱氏定氮蒸餾裝置 (2

31、)消化爐消化爐 (3)電子天平電子天平 2試劑試劑 (1)濃硫酸（化學(xué)純）濃硫酸（化學(xué)純） (2)硫酸鉀硫酸鉀-硫酸銅混合催化劑硫酸銅混合催化劑 (3)甲基紅甲基紅-溴甲酚綠混合指劑溴甲酚綠混合指劑 (4)2%硼酸溶液硼酸溶液 (5)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液（約標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液（約0.01mol/L） (6)40%NaOH (7)0.01mol/L HCl四、操作步驟四、操作步驟1、消化：在電子天平上稱取小麥粉、消化：在電子天平上稱取小麥粉0.2000g-0.4000g 置于凱氏試管底部置于凱氏試管底部加加混合混合催化劑混合混合催化劑0.5g和和3ml濃硫酸置于消化爐中高溫加熱至淡綠色透明（濃硫酸置于消化爐中

32、高溫加熱至淡綠色透明（2h左左右）取出放入通風(fēng)櫥內(nèi)至不冒白煙，向其中加右）取出放入通風(fēng)櫥內(nèi)至不冒白煙，向其中加20ml水，并移至水，并移至100ml容量瓶定容量瓶定容容即得樣品消化液。即得樣品消化液。 同時(shí)每同時(shí)每4組組8人做人做1空白實(shí)驗(yàn)：空白實(shí)驗(yàn)：0.5g混合催化劑混合催化劑+3ml濃硫酸置于凱氏試管中放入濃硫酸置于凱氏試管中放入消化爐加熱至淡綠色（消化爐加熱至淡綠色（1h左右）左右）冷卻后加水移入冷卻后加水移入100ml容量瓶中定容得空白容量瓶中定容得空白消化液。消化液。2. 蒸餾與吸收：吸取蒸餾與吸收：吸取10ml 2%的硼酸于三角瓶中的硼酸于三角瓶中加加4d甲基紅甲基紅-溴甲酚綠混合

33、指溴甲酚綠混合指示劑（若變綠色則用示劑（若變綠色則用0.01mol/L HCl調(diào)至紫紅色）。將其置于冷凝管下端并使管調(diào)至紫紅色）。將其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取尖插入液面以下，再吸取5ml消化液從漏斗上方加入蒸餾室內(nèi)用水洗兩次，并消化液從漏斗上方加入蒸餾室內(nèi)用水洗兩次，并加入加入10ml 40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗內(nèi)玻桿取下以防漏氣），然后打后水封（注意：勿使漏斗內(nèi)玻桿取下以防漏氣），然后打開通氣閥進(jìn)行加熱蒸餾，直至吸收液由紫紅色變成綠色，計(jì)時(shí)蒸餾開通氣閥進(jìn)行加熱蒸餾，直至吸收液由紫紅色變成綠色，計(jì)時(shí)蒸餾3min先移先移去吸收液再停止加熱以防倒吸。去吸收液再停止加熱以

34、防倒吸。3. 滴定：用滴定：用0.01mol/L HCl 滴定吸收液由綠色退去變紅色為止，記下耗去標(biāo)準(zhǔn)滴定吸收液由綠色退去變紅色為止，記下耗去標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積鹽酸的體積V1.V0。 C：標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度：標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度(0.01)。 V1：滴定樣品用去的鹽酸溶液平均毫升數(shù)。：滴定樣品用去的鹽酸溶液平均毫升數(shù)。 V0：滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均毫：滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均毫升數(shù)。升數(shù)。 W：樣品重量（：樣品重量（mg）。）。 14.01：氮的原子量。：氮的原子量。 K=5.7 M=12.5% V2=100ml V3=5ml五、結(jié)果計(jì)算五、結(jié)果計(jì)算100)1(01.14)(%

35、3201KVVMWVVc）蛋白質(zhì)含量（實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 甲醛滴定測氨基氮甲醛滴定測氨基氮 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1加深對氨基酸兩性解離的認(rèn)識。加深對氨基酸兩性解離的認(rèn)識。 2掌握甲醛滴定法的原理及應(yīng)用。掌握甲醛滴定法的原理及應(yīng)用。三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及材料三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及材料1. 實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)驗(yàn)儀器： 微量堿式滴定管（微量堿式滴定管（10ml）、）、2. 試劑：試劑： (1)0.5酚酞指示劑：。酚酞指示劑：。 (2)1甘氨酸即甘氨酸即1克加克加100ml水配制而成水配制而成 (3)0.1molL標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（使用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（使用前需標(biāo)定）。前需標(biāo)定）。 (4)中性甲醛溶液：取分析純

36、甲醛中性甲醛溶液：取分析純甲醛(3637)溶液溶液20ml，加，加0.5酚酞指示劑約酚酞指示劑約3滴，滴，滴加滴加0.100molL的氫氧化鈉溶液，使溶液的氫氧化鈉溶液，使溶液呈微粉紅色（臨用前中和）。呈微粉紅色（臨用前中和）。 氨基酸為兩性離子，在水溶液中有下列平衡：氨基酸為兩性離子，在水溶液中有下列平衡： RCHCOO- +2HCHO RCHCOO- + H+ NH3+ N(CH2OH)2 常溫下甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合生成亞羥甲基化合物，常溫下甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合生成亞羥甲基化合物，使上述平衡右移促使使上述平衡右移促使NH3+釋放釋放H+，從而使溶液酸度增加，從而使溶液酸度增

37、加，滴定終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)（滴定終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)（pH值值9.0左右），根據(jù)滴定左右），根據(jù)滴定終點(diǎn)時(shí)所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的量即可算出反應(yīng)體系中存在的游離氨終點(diǎn)時(shí)所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的量即可算出反應(yīng)體系中存在的游離氨基即氨基氮的含量如果樣品為一種已知的氨基酸，即可算出基即氨基氮的含量如果樣品為一種已知的氨基酸，即可算出該氨基酸的含量。如果樣品為未知氨基酸或幾種氨基酸的混該氨基酸的含量。如果樣品為未知氨基酸或幾種氨基酸的混合物，則只能算出其氨基氮的含量。合物，則只能算出其氨基氮的含量。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理四、操作方法四、操作方法 已知氨基酸溶液中氨基酸含量的測定已知氨基酸溶液中氨基酸含量的測定:

38、 取取3只三角瓶編號只三角瓶編號2ml 1% 甘氨酸甘氨酸2ml 1% 甘氨甘氨酸酸2ml 水（空白）水（空白） 均加均加5ml 水和水和5ml中性甲醛（用前加中性甲醛（用前加2滴滴 0.5% 酚酞酚酞滴加滴加0.1mol/LNaOH調(diào)至淡紅色），及調(diào)至淡紅色），及4滴滴 0.5%酚酚酞混勻酞混勻用用0.1mol/L滴至粉紅色出現(xiàn)為止滴至粉紅色出現(xiàn)為止分別記分別記下耗去標(biāo)準(zhǔn)堿的體積下耗去標(biāo)準(zhǔn)堿的體積(V1.V2.V0） 五、結(jié)果處理與計(jì)算五、結(jié)果處理與計(jì)算式中：式中：V：滴定樣品所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的平均體：滴定樣品所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的平均體積（積（ml）。）。 V0：滴定空白所消耗：滴定空白所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的

39、體積（標(biāo)準(zhǔn)堿的體積（ml）。）。 C：滴定時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的濃度：滴定時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的濃度（0.1molL）. 14.01：lml lmolL氫氧化鈉相當(dāng)于氫氧化鈉相當(dāng)于氮的質(zhì)量（氮的質(zhì)量（mg）。）。 100100/31/)2(/1100021475201.14)0(）（）甘氨酸含量（）（）甘氨酸含量（）氨基氮含量（mlgmlmgmlmgCVV 說明：說明： 1.本法優(yōu)點(diǎn)是簡單快速，缺點(diǎn)是不夠準(zhǔn)確，其準(zhǔn)本法優(yōu)點(diǎn)是簡單快速，缺點(diǎn)是不夠準(zhǔn)確，其準(zhǔn)確度僅達(dá)到氨基酸或氨基氮理論含量的確度僅達(dá)到氨基酸或氨基氮理論含量的90。而。而且，如果樣品液中含有脯氨酸或酪氨酸時(shí)滴定誤且，如果樣品液中含有脯氨酸或

40、酪氨酸時(shí)滴定誤差更大，因?yàn)楦彼崤c甲醛作用后生成不穩(wěn)定化差更大，因?yàn)楦彼崤c甲醛作用后生成不穩(wěn)定化合物使結(jié)果偏低，酪氨酸的酚基結(jié)構(gòu)又使結(jié)果偏合物使結(jié)果偏低，酪氨酸的酚基結(jié)構(gòu)又使結(jié)果偏高。高。 2甲醛滴定法常用以測定蛋白質(zhì)的水解程度。甲醛滴定法常用以測定蛋白質(zhì)的水解程度。 3中性甲醛需臨用前配制。放置一段時(shí)間后，中性甲醛需臨用前配制。放置一段時(shí)間后，在使用前需重新中和。在使用前需重新中和。六、思考題六、思考題 為什么說甲醛滴定法可以測定蛋為什么說甲醛滴定法可以測定蛋白質(zhì)的水解程度？除此之外還有哪白質(zhì)的水解程度？除此之外還有哪些方法可以用來測定蛋白質(zhì)的水解些方法可以用來測定蛋白質(zhì)的水解程度？程度？

41、 實(shí)驗(yàn)七酵母實(shí)驗(yàn)七酵母RNA的提取、組分鑒定和含量的提取、組分鑒定和含量測定測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?（1）了解并掌握稀堿法提取酵母）了解并掌握稀堿法提取酵母RNA的原理和方法。的原理和方法。 （2）了解核酸的組分并掌握其鑒定方法。）了解核酸的組分并掌握其鑒定方法。 （3）掌握地衣酚顯色法測定酵母）掌握地衣酚顯色法測定酵母RNA含量的原理和方法含量的原理和方法二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 酵母含酵母含RNA達(dá)達(dá)2.6710.0%，以酵母為原料，以酵母為原料使用稀堿使酵母裂解，然后用酸中和使用稀堿使酵母裂解，然后用酸中和,除去除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀R

42、NA。由此得到的由此得到的RNA為變性的為變性的RNA，可用作制，可用作制備核苷酸的原料。備核苷酸的原料。 用硫酸水解用硫酸水解RNA后后,可生成磷酸、戊糖和堿可生成磷酸、戊糖和堿基基,各成分用以下反應(yīng)加以鑒定：各成分用以下反應(yīng)加以鑒定：（1）磷酸與鉬酸銨試劑作用可生成黃色磷）磷酸與鉬酸銨試劑作用可生成黃色磷鉬酸銨沉淀。鉬酸銨沉淀。（2）核糖與地衣酚試劑作用呈鮮綠色。）核糖與地衣酚試劑作用呈鮮綠色。（3）嘌呤堿與硝酸銀反應(yīng)可生成白色的嘌）嘌呤堿與硝酸銀反應(yīng)可生成白色的嘌呤銀化物沉淀。呤銀化物沉淀。 RNA與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后

43、者與核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與3， 5-二羥甲二羥甲苯（地衣酚或苔黑酚）反應(yīng)呈鮮綠色，該反苯（地衣酚或苔黑酚）反應(yīng)呈鮮綠色，該反應(yīng)需用三氯化鐵和氯化銅作催化劑，反應(yīng)產(chǎn)應(yīng)需用三氯化鐵和氯化銅作催化劑，反應(yīng)產(chǎn)物在物在670nm處有最大吸收。處有最大吸收。RNA在在20250微克范圍內(nèi)，光吸收與微克范圍內(nèi)，光吸收與RNA濃度濃度 成正比。成正比。三、儀器和試劑三、儀器和試劑 1. 主要試劑主要試劑 （1）酵母粉）酵母粉 （2）0.04M NaOH溶液溶液 （3）1.5M硫酸硫酸 （4）無水乙醚）無水乙醚 （5）95乙醇乙醇 （6）濃氨水）濃氨水 （7）酸性乙醇溶液）酸性乙醇溶液 （8）濃硝酸）濃硝酸

44、 （9）0.1M AgNO3 （10）三氯化鐵）三氯化鐵-鹽酸溶液。鹽酸溶液。 （11）鉬酸銨試劑）鉬酸銨試劑 （12）50ugRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液 （13）苔黑酚）苔黑酚(3,5-二羥基甲苯二羥基甲苯)乙醇溶液乙醇溶液 （14）地衣酚）地衣酚-銅離子試劑銅離子試劑 （15）0.001M NaOH溶液溶液 2、器材：（、器材：（1）離心機(jī)）離心機(jī) （2）分光光度計(jì)）分光光度計(jì) （3）抽濾裝置。）抽濾裝置。 （4）電子天平）電子天平四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、酵母、酵母RNA提取提取 稱稱5g干酵母粉于干酵母粉于20mL 0.04M NaOH溶液中溶液中并在研缽中研成漿狀并轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。再

45、并在研缽中研成漿狀并轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。再用用10mL 0.04M NaOH溶液洗滌并轉(zhuǎn)入三角溶液洗滌并轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，沸水浴加熱燒瓶中，沸水浴加熱30min，冷卻，轉(zhuǎn)入離，冷卻，轉(zhuǎn)入離心管。心管。3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分，離心分，離心15分鐘后，將上清慢分鐘后，將上清慢慢傾入慢傾入 10mL酸性乙醇，邊加邊攪動(dòng)。加畢，酸性乙醇，邊加邊攪動(dòng)。加畢，靜置，待靜置，待RNA沉淀完全后，沉淀完全后，3000r/min離心離心3min。棄去上清液。用。棄去上清液。用95乙醇乙醇10 mL洗滌洗滌沉淀。再用乙醚沉淀。再用乙醚10 mL洗滌沉淀并將沉淀轉(zhuǎn)洗滌沉淀并將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾（先稱量濾紙重移至布氏漏斗抽濾

46、（先稱量濾紙重W1），沉），沉淀在空氣中干燥淀在空氣中干燥30min。稱量所得。稱量所得RNA粗品粗品和濾紙重和濾紙重W2。W2- W1即為即為RNA粗品重量粗品重量2、酵母、酵母RNA水解水解取取100 mg粗提的酵母粗提的酵母RNA于三角瓶中，加入于三角瓶中，加入1.5M硫酸硫酸10mL, 沸水浴加熱沸水浴加熱10分鐘制成水解液，分鐘制成水解液，然后進(jìn)行組份鑒定。然后進(jìn)行組份鑒定。3、RNA組份鑒定組份鑒定（1）嘌呤堿：）嘌呤堿：取水解液取水解液1mL于試管中滴加入于試管中滴加入40滴濃氨水。然后加入滴濃氨水。然后加入20滴滴0.1M硝酸銀溶液，觀察有無白色硝酸銀溶液，觀察有無白色嘌呤堿銀

47、化合物沉淀。嘌呤堿銀化合物沉淀。（2）核糖：）核糖：取水解液取水解液1mL于試管中加入三氯化鐵濃鹽酸溶液于試管中加入三氯化鐵濃鹽酸溶液40滴和苔黑酚乙醇溶液滴和苔黑酚乙醇溶液4滴。放沸水浴中滴。放沸水浴中10min。注意觀察核糖是否變成綠色。注意觀察核糖是否變成綠色。（3）磷酸：）磷酸：取水解液取水解液1mL于試管中加于試管中加5滴濃硝酸酸化，再加入滴濃硝酸酸化，再加入20滴鉬酸銨溶液在沸水浴上加熱，觀察有滴鉬酸銨溶液在沸水浴上加熱，觀察有無黃色磷鉬酸銨沉淀產(chǎn)生。無黃色磷鉬酸銨沉淀產(chǎn)生。 4. RNA含量測定含量測定 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：（每）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：（每4組組8人做人做1標(biāo)準(zhǔn)曲線）

48、標(biāo)準(zhǔn)曲線）以以RNA微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以A670為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （2）樣品的處理：）樣品的處理： 稱取稱取10mg粗提的酵母粗提的酵母RNA加入加入100 mL0.001M NaOH溶液溶液混勻即得樣品液混勻即得樣品液. （3）酵母）酵母RNA含量測定：含量測定： 取試管取試管1支加入支加入2 mL樣品液，再加樣品液，再加2 mL地衣酚地衣酚-銅試劑沸水銅試劑沸水加熱加熱25分鐘冷卻后測定分鐘冷卻后測定A(用用1號調(diào)零號調(diào)零) 四、結(jié)果處理四、結(jié)果處理 1. 酵母酵母RNA得率（得率（%）=（W2-W1）*100W 其中其中 W-干酵母粉重量（克）干

49、酵母粉重量（克） 2. 粗提的酵母粗提的酵母RNA含量（含量（%）=m*V1*100V2*W/ 其中其中 W/-酵母酵母RNA重量（重量（g） m-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得RNA的微克數(shù)的微克數(shù) V1-100 mL V2-2 mL實(shí)驗(yàn)八賴氨酸含量測定實(shí)驗(yàn)八賴氨酸含量測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆展任镏匈嚢彼岷康臏y定方法及原理。掌握谷物中賴氨酸含量的測定方法及原理。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)中賴氨酸的含量是谷物品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。由于動(dòng)物及人類不能合蛋白質(zhì)中賴氨酸的含量是谷物品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。由于動(dòng)物及人類不能合成，須從食物中得以補(bǔ)充，為此培育高含量賴氨酸的谷物，對于提高營養(yǎng)價(jià)

50、成，須從食物中得以補(bǔ)充，為此培育高含量賴氨酸的谷物，對于提高營養(yǎng)價(jià)值有重要意義。本實(shí)驗(yàn)分別用茚三酮溶液顯色法和染料結(jié)合法，測定小麥種值有重要意義。本實(shí)驗(yàn)分別用茚三酮溶液顯色法和染料結(jié)合法，測定小麥種子中賴氨酸含量。子中賴氨酸含量。谷物蛋白中賴氨酸殘基有自由的谷物蛋白中賴氨酸殘基有自由的NH3與茚三酮試劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，生成與茚三酮試劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色物質(zhì)，其顏色深淺與賴氨酸殘基的數(shù)目成正相關(guān)，而其它氨基酸沒有紫紅色物質(zhì)，其顏色深淺與賴氨酸殘基的數(shù)目成正相關(guān)，而其它氨基酸沒有自由氨基，不能發(fā)生這一反應(yīng)。選用碳原子數(shù)目與賴氨酸相同的亮氨酸，配自由氨基，不能發(fā)生這一反應(yīng)。選用碳原子數(shù)目與賴

51、氨酸相同的亮氨酸，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用以測定谷物蛋白內(nèi)賴氨酸的含量成標(biāo)準(zhǔn)溶液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用以測定谷物蛋白內(nèi)賴氨酸的含量。三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑 1主要儀器：主要儀器：（1）分光光度計(jì)）分光光度計(jì)（2）離心機(jī)）離心機(jī)（3）電子天平）電子天平2試劑：試劑：（1）茚三酮試劑）茚三酮試劑（2）2碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液（3）4碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液（4）0.1mg/ml亮氨酸溶液亮氨酸溶液（5）95%乙醇乙醇四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（每2組4人做1標(biāo)準(zhǔn)曲線） 以亮氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以以亮氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以A515縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

52、 2、樣品的處理與測定：在電子天平上稱取小麥粉、樣品的處理與測定：在電子天平上稱取小麥粉10mg于具塞試管底部于具塞試管底部加加1ml 2% 碳酸鈉于碳酸鈉于80水浴中保溫提取水浴中保溫提取10min加加2ml茚三銅試劑茚三銅試劑80水浴中保溫水浴中保溫30min后冷卻至后冷卻至室溫室溫加加5ml 95%乙醇和乙醇和5ml蒸餾水充分混勻后轉(zhuǎn)移至離心蒸餾水充分混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中管中3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分 離心離心3min（離心前必須平衡）（離心前必須平衡）取上清液測取上清液測A（以（以1號管調(diào)零）號管調(diào)零）五、結(jié)果計(jì)算五、結(jié)果計(jì)算 賴氨酸含量（賴氨酸含量（%） 式中：式中：m：標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的亮氨

53、酸的量：標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的亮氨酸的量(微克微克)； 1.11=Mlys/Mleu W：為樣品的干重（：為樣品的干重（mg）。）。 B=0.05B100W1011.1m3實(shí)驗(yàn)九、凝膠層析法分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)九、凝膠層析法分離蛋白質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子量的原理，了解凝膠層析法的學(xué)習(xí)凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子量的原理，了解凝膠層析法的操作方法。操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 凝膠層析又稱分子篩層析，是利用有一定孔徑凝膠層析又稱分子篩層析，是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠，對混合物中各組分按分子大小進(jìn)范圍的多孔凝膠，對混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)。把含有不同大

54、小分子的混合液，行分離的層析技術(shù)。把含有不同大小分子的混合液，鋪加在膠面上，讓它流過凝膠柱。由于凝膠具有網(wǎng)鋪加在膠面上，讓它流過凝膠柱。由于凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，當(dāng)混合液通過凝膠顆?？p隙中時(shí)，溶液中絡(luò)結(jié)構(gòu)，當(dāng)混合液通過凝膠顆粒縫隙中時(shí)，溶液中的溶質(zhì)凡是比網(wǎng)孔小的分子，都能自由進(jìn)入顆粒內(nèi)的溶質(zhì)凡是比網(wǎng)孔小的分子，都能自由進(jìn)入顆粒內(nèi)部而受阻滯部而受阻滯,流速緩慢流速緩慢,流程長而后被洗脫；而比網(wǎng)流程長而后被洗脫；而比網(wǎng)孔大的分子則不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的孔大的分子則不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙先被洗脫空隙先被洗脫(阻力小阻力小,流程短流程短,流速大流速大)。因此，在洗。因此，在洗脫小分

55、子物質(zhì)后流出（洗脫體積大），從而達(dá)到分脫小分子物質(zhì)后流出（洗脫體積大），從而達(dá)到分離的目的。離的目的。三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑1.主要儀器：主要儀器：（1）凝膠層析儀）凝膠層析儀（2）電子天平）電子天平（3）層析柱）層析柱2.試劑：試劑：（1）Sephadex G100（2）牛血清白蛋白）牛血清白蛋白（3）細(xì)胞色素）細(xì)胞色素C（4）血紅蛋白）血紅蛋白（5）核糖核酸酶）核糖核酸酶 四、操作步驟四、操作步驟 1、凝膠的選擇與處理：稱取凝膠干粉加過量水浸泡過夜，棄去上層細(xì)、凝膠的選擇與處理：稱取凝膠干粉加過量水浸泡過夜，棄去上層細(xì) 小顆粒混勻后裝柱小顆?；靹蚝笱b柱2. 裝柱：將柱子垂直固

56、定在鐵架上，先向主內(nèi)加入四分之一柱長水，裝柱：將柱子垂直固定在鐵架上，先向主內(nèi)加入四分之一柱長水，再將凝膠倒入柱內(nèi)，打開下端開口，繼續(xù)灌入凝膠，直至床面距上端再將凝膠倒入柱內(nèi)，打開下端開口，繼續(xù)灌入凝膠，直至床面距上端5cm左右，觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，有無氣泡及斷層出現(xiàn)。左右，觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，有無氣泡及斷層出現(xiàn)。3. 平衡：柱子裝好后放置平衡：柱子裝好后放置20min，用洗脫液平衡柱子直至床面不再下，用洗脫液平衡柱子直至床面不再下降為止，用藍(lán)色葡聚糖降為止，用藍(lán)色葡聚糖2000檢測柱子是否均勻。檢測柱子是否均勻。4. 上樣與洗脫：加樣前檢查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒攪拌凝上樣與洗脫：

57、加樣前檢查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒攪拌凝膠使其自然下沉，在膠面上放置圓形濾紙片防止加樣時(shí)沖擊床面，用膠使其自然下沉，在膠面上放置圓形濾紙片防止加樣時(shí)沖擊床面，用膠頭滴管吸去上層多余水，然后慢慢滴加膠頭滴管吸去上層多余水，然后慢慢滴加10d牛血清蛋白樣品（每組牛血清蛋白樣品（每組8人加人加1次樣，兩次加樣間隔次樣，兩次加樣間隔20min），待樣品進(jìn)入凝膠后，向床面滴加），待樣品進(jìn)入凝膠后，向床面滴加2cm高度水防止干膠，擰緊螺絲；打開恒流泵，紫外檢測儀，記錄儀高度水防止干膠，擰緊螺絲；打開恒流泵，紫外檢測儀，記錄儀及部分收集記下初始筆尖位置，直至峰值出現(xiàn)記錄筆移動(dòng)距離及部分收集記下初始筆尖

58、位置，直至峰值出現(xiàn)記錄筆移動(dòng)距離L。5、儀器參數(shù)設(shè)置及調(diào)整：紫外檢測儀：當(dāng)檔位置于、儀器參數(shù)設(shè)置及調(diào)整：紫外檢測儀：當(dāng)檔位置于100%T時(shí)，調(diào)光時(shí)，調(diào)光量至數(shù)顯為量至數(shù)顯為100。當(dāng)檔位置于。當(dāng)檔位置于0.5A時(shí)時(shí) 調(diào)調(diào)A數(shù)顯為數(shù)顯為0 記錄儀：設(shè)置紙速記錄儀：設(shè)置紙速2cm/h 部分收集器：設(shè)置每部分收集器：設(shè)置每10min收集收集1管，調(diào)恒流泵流速使每管收管，調(diào)恒流泵流速使每管收集液體為集液體為4ml 即即v=0.4ml/min五、結(jié)果計(jì)算五、結(jié)果計(jì)算 1、以管號（或洗脫液體積）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)管的、以管號（或洗脫液體積）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)管的A280為縱為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。坐標(biāo)，繪制洗脫曲

59、線。 2、根據(jù)洗脫峰位置量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積、根據(jù)洗脫峰位置量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve，然后，然后以蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)值（以蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)值（logMr）為橫坐標(biāo)、）為橫坐標(biāo)、Ve為縱坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)，作出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。作出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3、樣品完全按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作，根據(jù)紫外檢測獲、樣品完全按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作，根據(jù)紫外檢測獲得的洗脫體積，從分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的分子量。得的洗脫體積，從分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的分子量。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1.層析柱上方要留有少量液體，避免使凝膠暴露于空氣中層析柱上方要留有少量液體，避免使凝膠暴露于空氣中 2. 凝膠過濾上樣時(shí)，使樣品

60、沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面凝膠過濾上樣時(shí)，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面實(shí)驗(yàn)十：酵母蔗糖酶的提取及部分純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂?、?shí)驗(yàn)?zāi)康模?學(xué)習(xí)酶的提取和純化方法，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供一定量的蔗糖酶。學(xué)習(xí)酶的提取和純化方法，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供一定量的蔗糖酶。二、實(shí)驗(yàn)原理：二、實(shí)驗(yàn)原理： 蔗糖酶（蔗糖酶（invertase）（）（-D-呋喃果糖苷果糖水解（呋喃果糖苷果糖水解（fructofuranoside fructohydrolase）（）（EC.3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的）特異地催化非還原糖中的呋喃果呋喃果糖苷鍵水解，具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，糖苷鍵水解，具