GPNMB促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的作用及其機(jī)制

1、GPNMB進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的作用及其機(jī)制周圍神經(jīng)損傷是臨床常見損傷，損傷后的再生修復(fù)涉及很多因素，其中施萬細(xì)胞(Schwanncells,SCs)在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用。周圍神經(jīng)損傷后,SCs 通過上調(diào)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophicfactors,NTFs)和粘附分子的表達(dá)，并在損傷局部募集巨噬細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞共同吞噬裂解的軸突和髓鞘，改善再生微環(huán)境；在基膜內(nèi)形成 Btngners 帶，引導(dǎo)軸突再生；軸突再生后，SCs 包繞其形成髓鞘，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。損傷遠(yuǎn)側(cè)端 SCs 長(zhǎng)期失神經(jīng)，則導(dǎo)致周圍神經(jīng)再生能力下降，影響神經(jīng)修復(fù)。因此，激活失神經(jīng) SCs,促進(jìn) SCs

2、增殖、分化、遷移、表達(dá)和分泌 NTFs 等，或者通過補(bǔ)充外源性營養(yǎng)因子、小分子物質(zhì)等改善再生微環(huán)境，是治療周圍神經(jīng)損傷的重要策略。非轉(zhuǎn)移性糖蛋白黑色素瘤蛋白B(GlycoproteinNon-MetastaticMelanomaProteinB,GPNMB池叫骨活化素(osteoactivin,OA)、樹突狀細(xì)胞肝素整合素配體(dendriticcell-heparinintegrinligand,DC-HIL)、造血生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)激肽-I 型(hematopoieticgrowthfactorinducibleneurokinin-Itype,HGFIN),是一種 I 型跨膜蛋白， 最早

3、發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤細(xì)胞中。 GPNMB 泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有非常重要的作用：如改善記憶、抗炎、減少神經(jīng)元死亡、保護(hù)神經(jīng)元。GPNMB 周圍神經(jīng)系統(tǒng)特別是 SCs 也有表達(dá)，然而，它對(duì) SCs 和周圍神經(jīng)系統(tǒng)是否有激活或者保護(hù)作用，以及在周圍神經(jīng)再生修復(fù)中的作用仍不清楚?；谝陨峡紤]，本研究通過對(duì)坐骨神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)側(cè)端進(jìn)行基因芯片分析，了解 GPNMB周圍神經(jīng)損傷后的表達(dá)變化，并探討 GPNMB 周圍神經(jīng)損傷再生修復(fù)的作用和對(duì)SCs 的作用及其機(jī)制,為 GPNMB 臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分坐骨神經(jīng)損傷后 GPNMB 表達(dá)變化目的：通過對(duì)坐骨神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)側(cè)端進(jìn)行基因芯片分析，以了解損傷

4、神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端基因表達(dá)變化，尤其是 GPNMB 表達(dá)變化。方法：對(duì)坐骨神經(jīng)橫斷傷后 0、1、3、7、14、21、28d,遠(yuǎn)側(cè)端進(jìn)行基因芯片分析，STEM 分析篩選表達(dá)變化趨勢(shì)顯著性的基因集，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和聚類分析。篩選出其中變化最明顯的基因， 并使用 qRT-PCR 免疫印跡(Westernbloting,WB)、 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)對(duì)其在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：在坐骨神經(jīng)橫斷損傷后 0、1、3、7、14、21、28d,遠(yuǎn)側(cè)端基因表達(dá)趨勢(shì)顯著性的基因集共有12 個(gè)，其中基因集 41 的表達(dá)趨勢(shì)在坐骨神經(jīng)損傷后先上升、至峰值、繼而下降，

5、而這種變化趨勢(shì)與遠(yuǎn)側(cè)端急性失神經(jīng) SCs 的增殖趨勢(shì)相一致。GOKEG 份析預(yù)測(cè)基因集 41 中的基因可能參與細(xì)胞增殖過程。 聚類分析發(fā)現(xiàn) GPNMB 基因集 41 中表達(dá)變化最明顯的基因，其表達(dá)從 1d 開始上升、從 3d 開始迅速上升，至 7d時(shí)上升至峰值,約為 0d 的 48 倍、從 14d 開始下降，直至 28d 下降至 0d 的 15 倍左右。qRT-PCRWBIHC 結(jié)果顯示 GPNMB 表達(dá)趨勢(shì)和芯片結(jié)果基本一致。結(jié)論：在坐骨神經(jīng)損傷后，損傷遠(yuǎn)側(cè)端 GPNMB 達(dá)變化最明顯，且呈先上升、至峰值、繼而下降的趨勢(shì)，GPNMBT能參與坐骨神經(jīng)損傷后的自我再生修復(fù)過程，尤其是細(xì)胞增殖的過

6、程。第二部分 GPNMB 進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷再生修復(fù)目的：探討 GPNMB 坐骨神經(jīng)損傷再生修復(fù)的作用方法：坐骨神經(jīng)重度壓榨傷模型建模后 3 周，于損傷處由遠(yuǎn)及近、多點(diǎn)注射重組人 GPNMB(rhGPNMB)白或 PBS,實(shí)驗(yàn)大鼠共分為 3 組:PBS 組、100ngrhGPNMffi、 500ngrhGPNMBfi,并于 4 周后進(jìn)行檢測(cè)。 免疫熒光檢測(cè) SCs 增殖及軸突、髓鞘的再生； 透射電鏡觀察髓鞘的超微結(jié)構(gòu)并計(jì)算 G-Ratio 值;體外檢測(cè)損傷神經(jīng)興奮傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位振幅；注射 rhGPNMB!的每周觀察大鼠行走足印、計(jì)算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，檢測(cè)神經(jīng)功能恢復(fù)情況；觀察腓腸肌大體形態(tài)、對(duì)

7、腓腸肌稱重、HE 染色檢測(cè)其萎縮情況。結(jié)果:rhGPNMB&SCs 數(shù)目、再生軸突數(shù)、再生髓鞘數(shù)以及增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)均明顯多于 PBSffl，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。100ngrhGPNMB1 和 500ngrhGPNMBI 的 SCs 數(shù)量分別為 PBSffl 白 1.550.21 和 2.750.28 倍，且形狀和排列上更加規(guī)則；再生軸突數(shù)為PBS&的 1.380.19 和 1.780.18 倍，且分布更加均勻、直徑更大、延續(xù)性更完整；再生髓鞘數(shù)分別為 PBS 組的 1.180.18、1.670.08 倍,且完整性更好、分布更加均勻。透射電鏡 2 果顯示：rhGPNMEfi

8、 再生髓鞘數(shù)多于 PBSI&，形狀更加完整、髓鞘板層較厚 且 更 加 致 密 ， 微 管 、 微 絲 等 超 微 結(jié) 構(gòu) 排 列 更 規(guī) 則 。 計(jì) 算 G-Ratio值,500ngrhGPNMBIG-Ratio 值最小,表明其再生髓鞘厚度最厚,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，100ngrhGPNMBI500ngrhGPNM 的組的動(dòng)作電位振幅分別為 PBSffl 的 1.100.22 和 1.440.30 倍；神經(jīng)興奮傳導(dǎo)速度分別為 PBS 組的1.320.08、2.150.17 倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按照 3 組大鼠行走足印，計(jì)算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，PBS、100ngrhGPNM

9、B500ngrhGPNMB 到坐骨神經(jīng)功能指數(shù)均有降低，至第 4周 3 組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)值分別為-72.835.85、-60.064.77、-40.605.00,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明坐骨神經(jīng)在損傷再生修復(fù)過程中,3 組神經(jīng)功能均有一定的恢復(fù)，而 rhGPNMBT 促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后功能的進(jìn)一步恢復(fù)。大體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn) rhGPNMB 腓腸肌萎縮較 PB&輕，尤其是 500ngrhGPNMB 組。PBS100ngrhGPNMB500ngrhGPNMBfi 腓腸肌質(zhì)量分別為正常腓腸肌質(zhì)量的(44.684.08)%、(54.553.05)%、(66.854.10)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、。橫切面 HE 吉果顯示 rhGPNMB!肌纖維直徑和截面積顯著大于 PBSA,尤其是500ngrhGPNMBfl,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：GPNMBE 進(jìn)損傷坐骨神經(jīng) SCs 增殖、軸突再生以及損傷神經(jīng)再髓鞘化；改善其電生理特性；促進(jìn)損傷坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)，延緩腓腸肌萎縮?？傊?GPNM 隨進(jìn)損傷坐骨神經(jīng)再生修復(fù)。第三部分 GPNMBSCs 的作用及其機(jī)制目的：探討 GPNMBSCs 的作用及其機(jī)制。方法： 在施萬細(xì)胞系 RSC96W 養(yǎng)基中分別加入 12.5ng/ml 或 25ng/mlrhGPNMB,CC 儂和W 前測(cè) RSC96 勺增殖;TUNEL 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) RSC96 勺凋亡;細(xì)胞

11、戈 U 痕法檢測(cè) RSC96 勺遷移;qRT-PCRWBELISA 檢測(cè) RSC96NTFift 粘附分子的表達(dá)和分泌;WB 檢測(cè) Erk1/2、 Akt 磷酸化；免疫共沉淀、免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè) rhGPNMB 與 RSC961 膜上哪種蛋白結(jié)合；使用該蛋白拮抗劑或干擾 RNA(smallinterferingRNA,siRNA)慢病毒與 rhGPNM 映同處理 RSC96,CCK8fc、 細(xì)胞劃痕法、 WBELISA分別檢測(cè) RSC96 勺增殖、遷移、以及 NTFs 和粘附分子表達(dá)、分泌;WB 檢測(cè) Erk1/2、Akt磷酸化。結(jié)果：RSC96 在加入 rhGPNM 蛤養(yǎng) 1d 時(shí)，增殖無明顯

12、變化；從 2d 開始，增殖明顯高于對(duì)照組；培養(yǎng) 3d 時(shí),rhGPNMBfiRSC96：曾殖細(xì)胞核抗原表達(dá)明顯高于對(duì)照組，尤其是 25ng/mlrhGPNMB 組。25ng/mlrhGPNMBffl 增殖明顯快于 12.5ng/mlrhGPNMB 和對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhGPNM 酎 RSC96W 亡無明顯作用25ng/mlrhGPNM 幽劃痕修復(fù)速度較快，在 48h 時(shí)，修復(fù)達(dá)到(70.350.20)%,高于12.5ng/mlrhGPNMB 組的(59.741.76)%和對(duì)照組的(41.230.82)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhGPNMB!進(jìn) NGFBDNFNT-3 和 N-cad

13、herin 在轉(zhuǎn)錄、蛋白水平的表達(dá)和分泌。同時(shí) 25ng/mlrhGPNMB 組 p-Erk/total-Erk、p-Akt/total-Akt 分別為對(duì)照組的4.200.21、2.580.52 彳 t,亦高于 12.5ng/mlrhGPNMB 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫共沉淀結(jié)果顯示 rhGPNMB 口 NKAx1 可共沉淀， 免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示 rhGPNMB 口 NKAx1共定位于 RSC96 包膜上,這說明 rhGPNM 骷合 RSC96 包膜上的 NKAx1。NKA 桔抗劑 Ouabain 和 rhGPNM 共同處理 RSC96 寸,RSC96 增殖速度、劃痕修復(fù)速度、NTFs 和 N-cadherin 的表達(dá)和分泌、 p-Erk/total-Erk、 p-Akt/total-Akt 與單用 rhGPNMB!比明顯降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 而與對(duì)照組和單用 Ouabain 無明顯差異。 NKAx1siRNA和 rhGPNM 共同處理 RSC96 寸,NKAa1siRNA+rhGPNMB 組 RSC96t 曾殖速度、劃