基因表達(dá)載體的構(gòu)建最新版本

1、.1第六章第六章 外源基因在大腸桿外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)調(diào)控菌中的表達(dá)調(diào)控 第一節(jié)基因表達(dá)的概述和基本條件 第二節(jié)在大腸桿菌中影響外源基因表達(dá)的因素.2第一節(jié)基因表達(dá)的概述和基本條件 一、基因表達(dá)的基本概念 二、基因表達(dá)的基本條件 三、真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控.3第二節(jié)在大腸桿菌中影響外源基因表達(dá)的因素 一、啟動子結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響 二、表達(dá)載體的選擇 三、外源基因（cDNA）中密碼子的作用 四、mRNA的一級結(jié)構(gòu)與基因表達(dá) 五、mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的影響 六、mRNA穩(wěn)定性的影響 七、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對外源基因表達(dá)效率的影響 八、轉(zhuǎn)錄后的若干因素與基因表達(dá)的關(guān)系 九、宿主選擇對

2、表達(dá)的影響 十、培養(yǎng)條件的控制對表達(dá)效率的影響.4一、基因表達(dá)的基本概念生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表達(dá)是目的基因DNA在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)?；虻谋磉_(dá)依賴于有效的轉(zhuǎn)錄和mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關(guān)鍵，原核的基因表達(dá)過程和方式與真核細(xì)胞有顯著不同。.5二、基因表達(dá)的基本條件 1.外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯(cuò)位及錯(cuò)碼。否則會導(dǎo)致編碼錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點(diǎn)的識別序列。 2.插入的外源基因必須

3、放在原核的啟動子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識別插入的基因。 3.外源基因必須能在大腸桿菌中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的mRNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且能有效地進(jìn)行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。.6三、真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控 真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控的特點(diǎn) 有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件 正確轉(zhuǎn)譯正確轉(zhuǎn)譯 原核表達(dá)載體的構(gòu)建原核表達(dá)載體的構(gòu)建.7 有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件 1.RNA聚合酶 2.啟動子及其轉(zhuǎn)錄作用的啟動（啟動子的概念、分類） 3.轉(zhuǎn)錄作用的終止 4.轉(zhuǎn)錄的弱化作用.8 正確轉(zhuǎn)譯正確轉(zhuǎn)譯 1.起始

4、密碼子（intiqtioncodon,initiator） 2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS，又稱SD序列）.9 原核表達(dá)載體的構(gòu)建原核表達(dá)載體的構(gòu)建 原核表達(dá)載體的構(gòu)建的要求 1.表達(dá)載體類型 2.表達(dá)載體的舉例 3.包涵體表達(dá)載體.10啟動子 乳糖啟動子（Lac） Trp啟動子 Tac啟動子 噬菌體的PL和PR啟動子 脂蛋白啟動子（LPP）.11啟動子結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響 啟動子-35區(qū)和-10區(qū)序列與通用轉(zhuǎn)錄序列一致，間距為17bp，大于17bp效果差，不同產(chǎn)物選用不同啟動子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL啟動子效果好。.12表達(dá)載體的選擇 載體分子量不宜過大，以2.5-5.

5、6kb為佳，高拷貝，不同產(chǎn)物選用不同類型表達(dá)載體。.13外源基因（cDNA）中密碼子的作用 細(xì)菌中基因表達(dá)對密碼子有偏愛性，不偏愛的稀有密碼子（AGA、AGG）表達(dá)效果差，特別當(dāng)有AGA-AGG連續(xù)序列存在時(shí)表達(dá)效率低.14mRNA的一級結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)啟始密碼子：表達(dá)效率AUGGUGUUGSD序列：較長的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列與AUG間距一般6-12bp，4-10bp較佳，9bp最佳；SD序列的5非翻譯區(qū)，若有5-UGAUCU，則有增強(qiáng)作用。.15mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的影響 mRNA形成二級結(jié)構(gòu)時(shí)，可產(chǎn)生莖環(huán)。若SD序列、AUG位于莖環(huán)內(nèi)或發(fā)夾內(nèi)，轉(zhuǎn)譯受

6、抑制；在莖環(huán)外則有利于轉(zhuǎn)譯。見表6-1.16mRNA穩(wěn)定性的影響 REP序列可阻止mRNA降解，偏愛密碼子也起保護(hù)作用。.17真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控的特點(diǎn)只有一種RNA聚合酶以操縱子為單位來完成基因轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄無RNA剪接功能因無核仁、核膜，核酸均為裸露的，轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在多聚核糖體上合成，同時(shí)合成多條肽鏈有特有SD序列，調(diào)控mRNA與核糖體有效結(jié)合和翻譯的起始無糖基化功能.18RNA聚合酶 原核細(xì)胞只有一種RNA聚合酶，當(dāng)其核心酶與因子結(jié)合，形成全酶后，才能識別DNA上的啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。.19啟動子的概念 啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，

7、內(nèi)含-35區(qū)（與因子結(jié)合）和-10區(qū)（和核心酶結(jié)合）的保守序列。當(dāng)啟動子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄，如圖6-1。.20轉(zhuǎn)錄作用的終止 由轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)揮作用，凡能使轉(zhuǎn)錄終止的有關(guān)的DNA的序列稱終止子。 強(qiáng)終止子：不依賴因子發(fā)揮終止作用，回文序列中G/C配對多，有四個(gè)以上U，致使RNA聚合酶構(gòu)象改變而終止轉(zhuǎn)錄。如圖6-9,如圖6-10 弱終止子：依賴因子發(fā)揮終止作用。如圖6-11.21轉(zhuǎn)錄的弱化作用 轉(zhuǎn)錄的弱化作用使轉(zhuǎn)錄沒有到達(dá)終止信號處而中途停止轉(zhuǎn)錄，使mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生部分停止，而不是發(fā)生全部停止。.22起始密碼子 起始密碼子是編碼多肽鏈第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼

8、甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細(xì)菌中也有罕見的起始密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達(dá)作用AUGGUG。.23核糖體結(jié)合位點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄mRNA的AUG上游具有的，能與核糖體發(fā)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯所需要的序列（RBS），長度為3-9bp，距AUG3-11bp，它與16srRNA3末端（AUUCCUCCAC-DAG-5）互補(bǔ)其互補(bǔ)程度、SD與AUG間距等與轉(zhuǎn)譯效果有關(guān)。如圖.24表達(dá)載體類型表達(dá)載體的類型主要有四種：非融合型表達(dá)載體，如PKK223-3如圖6-14分泌型表達(dá)載體，如PIN-ompA1如圖6-15融合蛋白型表達(dá)載體，如PGEX如圖6-161.包涵體型表達(dá)載體，如pBV220如圖6-17.25原核表達(dá)

9、載體的構(gòu)建的要求 完整的表達(dá)載體（質(zhì)粒）應(yīng)有強(qiáng)啟動子（P）、終止子（T）、多個(gè)酶切位點(diǎn)、有抗性標(biāo)記、復(fù)制子和RBS的SD序列。（如圖6-13）還應(yīng)結(jié)合考慮：質(zhì)粒的拷貝能力和穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)譯蛋白的表達(dá)形式和存放地點(diǎn)（分泌型/包涵體/融合蛋白），蛋白質(zhì)的分子量、性質(zhì)和穩(wěn)定性以及選擇合適宿主細(xì)胞。.26乳糖啟動子（Lac） 無乳糖時(shí)，調(diào)節(jié)基因（I）產(chǎn)生阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止RNA聚合酶結(jié)合進(jìn)而阻止轉(zhuǎn)錄；有乳糖時(shí)，乳糖能與阻遏蛋白結(jié)合，使其變構(gòu)解離而行使轉(zhuǎn)錄功能。如圖6-2 而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。Lac啟動子改建如圖6-3、6-4(a)(b).27Trp啟動子

10、 色氨酸啟動子（Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸時(shí)，二者結(jié)合，阻遏蛋白變構(gòu)激活而與啟動子結(jié)合，阻止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。無色氨酸時(shí)，阻遏解除，因-吲哚丙烯酸是色氨酸的競爭性抑制劑，常用作誘導(dǎo)劑，誘發(fā)色氨酸啟動子轉(zhuǎn)錄。（如圖6-5）同時(shí)，衰減子對Trp轉(zhuǎn)錄也有調(diào)節(jié)作用（如圖6-6）.28Tac啟動子 Tac啟動子是由Trp啟動子和Lac啟動子構(gòu)建而成的雜合啟動子，-35區(qū)為Trp啟動子順序，-10為LacUV5啟動子順序，二者之間距離為16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該啟動子只需用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄即可。如圖6-7.29噬菌體的PL和PR啟動子 PL為左向啟動區(qū)，PR為右向轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)，與CI阻遏蛋白結(jié)合，可抑制OL或OR轉(zhuǎn)錄，但CI在42誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄（如圖6-8）。.30脂蛋白啟動子（LPP） 脂蛋白為細(xì)胞外膜蛋白，細(xì)菌中含量高，該啟動子表達(dá)效率高，由信號肽可將基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，常用來