蛋白質(zhì)的修飾和表達03

1、雙鏈雙鏈DNADNA：一般制備一般制備DNADNA質(zhì)粒質(zhì)粒 的方法均可的方法均可單鏈單鏈DNADNA：通過通過M13M13噬菌體或噬菌體或 噬菌粒來制備噬菌粒來制備例子例子：將：將NCBINCBI數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)庫中的MADSMADS基因編碼蛋白質(zhì)基因編碼蛋白質(zhì)的的“KKACSDSSA”KKACSDSSA”中的中的C C（CysCys）定點突變?yōu)椋┒c突變?yōu)锳 A（ArgArg）。）。 5端或端或3端區(qū)產(chǎn)生突變端區(qū)產(chǎn)生突變直接直接PCR 中心區(qū)突變中心區(qū)突變重疊延伸（重疊延伸（overlap extension） 新概念新概念：Gene SOEing:即通過重疊延伸進行剪接即通過重疊延伸進行剪接

2、（splicing by overlap extension）,也就是說通過重組延也就是說通過重組延伸方法將不同的基因進行剪接和組合在一起伸方法將不同的基因進行剪接和組合在一起。DNADNA片片段段的的剪剪切切n1990年年Saccharomydes cerevisiae發(fā)現(xiàn)在腺苷三磷酸核發(fā)現(xiàn)在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白質(zhì)會發(fā)生自我剪苷酸酶中蛋白質(zhì)會發(fā)生自我剪接（接（protein splicing），從而），從而首次發(fā)現(xiàn)第一個蛋白質(zhì)內(nèi)含首次發(fā)現(xiàn)第一個蛋白質(zhì)內(nèi)含子子Sce VMA n蛋白質(zhì)內(nèi)含子蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是蛋白是蛋白質(zhì)中的一段多肽鏈質(zhì)中的一段多肽鏈, 它靠自我剪它靠自我剪切的方

3、式從前體蛋白中分離出切的方式從前體蛋白中分離出來來, 而兩端的外顯子以肽鍵的方而兩端的外顯子以肽鍵的方式相連式相連 RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點RNARNA聚合酶識別位點聚合酶識別位點 減少不必需的轉(zhuǎn)錄通減少不必需的轉(zhuǎn)錄通過復制起始位點，其作用過復制起始位點，其作用可以幫助穩(wěn)定可以幫助穩(wěn)定mRNA，增，增加加mRNA的半衰期的半衰期 保證目保證目標基因完標基因完全被轉(zhuǎn)錄全被轉(zhuǎn)錄mRNAmRNA轉(zhuǎn)錄速率越高轉(zhuǎn)錄速率越高mRNAmRNA降解速率越低降解速率越低高高核糖體結合位點（核糖體結合位點（SDSD序列）序列）SDSD序列與起始密碼之間的距離序列與起始密碼之間的距離起始密碼上游區(qū)的序列起始密碼上游區(qū)的序列SDSD序列與可翻譯序列序列與可翻譯序列55端形成的二級結端形成的二級結構構遺傳密碼的使用（高頻或低遺傳密碼的使用（高頻或低頻）等頻）等多加入終止密碼子（串聯(lián)終多加入終止密碼子（串聯(lián)終止子）止子）錯誤氨基酸的攙入錯誤氨基酸的攙入 M13 M13噬菌體是一種單鏈噬菌體是一種單鏈DNADNA噬菌體，但它在感染宿主（大噬菌體，但它在感染宿主（大腸桿菌）后，在菌體細胞內(nèi)復腸桿菌）后，在菌體細胞內(nèi)復制成為雙鏈并