吡啶誘導(dǎo)白毛真菌三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素的調(diào)節(jié)E.P

1、 吡啶誘導(dǎo)白毛真菌三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素的調(diào)節(jié)E.P.Feofilova,V.M.Tereshina,and A.S.Memorskaya微生物研究所，俄羅斯科學(xué)學(xué)會(huì)，pr.60-letlya Oktyabrya 7,k,2,Moscow,117811 Russia,1994年10月8號(hào)摘要：吡啶誘導(dǎo)刺激三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素。6-甲基-2氨基吡啶被證明是最有效的刺激劑。利用放線(xiàn)菌和放線(xiàn)素是基因調(diào)節(jié)從頭合成的刺激反應(yīng)器。6-甲基-2氨基吡啶在三孢布拉氏霉菌合成類(lèi)胡蘿卜素中的作用是抑制環(huán)化酶和一些脫氫酶，刺激類(lèi)胡蘿卜素前體和一種抗氧化劑的合成。6-甲基-3-乙基-3-羥基吡啶是一

2、種抗氧化劑，在加入6-甲基-2氨基吡啶的條件下，產(chǎn)生一種作用刺激生物合成番茄紅素。提出了三孢布拉氏菌合成番茄紅素中可能的生物作用。 在現(xiàn)代生物工藝學(xué)中，被稱(chēng)為化學(xué)生物調(diào)節(jié)器的特殊復(fù)合物的利用是獲得次生代謝物的一種有效方法，例如：-紫羅酮，三孢酸和VA通過(guò)白毛真菌三孢布拉氏菌增加-胡蘿卜素產(chǎn)量10-15倍。 前幾年，另一種類(lèi)胡蘿卜素番茄紅素，由于它好的抗氧化作用，在生物工藝學(xué)和藥學(xué)中吸引了特殊的關(guān)注。它還被用做天然染料，把食品染色成紅色和桃紅色。番茄紅素的化學(xué)合成與微生物合成相比，在經(jīng)濟(jì)上較差，工業(yè)復(fù)合過(guò)程較好。三烴基銨氯化物和吡啶這些生物調(diào)節(jié)劑在植物、真菌和細(xì)胞中的使用抑制胡蘿卜素的生物合成，

3、增強(qiáng)了番茄紅素的產(chǎn)率。相似研究表明，-胡蘿卜素的超級(jí)生產(chǎn)物，即三孢布拉氏霉菌，在工業(yè)上是用來(lái)生產(chǎn)-胡蘿卜素的。生物調(diào)節(jié)劑的使用使番茄紅素的產(chǎn)量增至1.0-1.5g/l（培養(yǎng)基）成為可能，但是，生物調(diào)節(jié)劑的作用機(jī)理還不明確。阻止了生物工程的更進(jìn)一步發(fā)展。由于這個(gè)原因，我們工作的目的是尋找新的生物合成番茄紅素的刺激劑，并闡明該合成過(guò)程和刺激劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，以及尋找一個(gè)新的方法來(lái)闡明三孢布拉氏霉菌在生物合成番茄紅素中的刺激作用的機(jī)理。材料與方法這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中使用了三孢布拉氏霉菌菌株（+）-A-732和（-）-A-732（由A.I.Kiseleva提供）。該菌絲體在添加了2%的葵花子油的玉米-大豆

4、培養(yǎng)基，并在26-29。C，搖床（230-240r/min）作用下生長(zhǎng).該真菌在含有50ml該培養(yǎng)基的250ml容量瓶中生長(zhǎng)。（+）/（-）孢子比例為1：15的孢子懸液被用作接種體。 -胡蘿卜素和番茄紅素的含量是通過(guò)Unicam SP 1800分光光度計(jì)測(cè)得，或者使用丙酮提取真菌生物量，再用正己烷提取類(lèi)胡蘿卜素之后使用SF-56 LOMO分光光度計(jì)測(cè)量；根據(jù)Brockman在4中的描述，在Al4+培養(yǎng)皿中用薄層色譜法測(cè)量。后者常用于測(cè)定-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、-胡蘿卜素和鏈孢紅素的含量；在4中出項(xiàng)的E值是用于計(jì)算這些多烴的含量的。 三孢布拉氏霉菌菌絲體的碳水化合物的分析 在沸水

5、中煮二十分鐘后，提取四次碳水化合物。使用Dowex-50W(H+)和Dowex-1（醋酸鹽形式），通過(guò)離子交換色譜法移出蛋白質(zhì)，然后將純化的蛋白質(zhì)樣本低壓凍干。碳水化合物然后轉(zhuǎn)化為三甲基甲硅烷衍生物，用5%的SE-30緩和的紅色硅藻色譜載體裝成的兩米玻璃柱,使用氣-液色譜法驗(yàn)證，用3700-模式氣-液色譜和從170到270。C溫度梯度。肌糖，葡萄糖，海藻糖，甘露糖，蔗糖，棉子糖被作為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。 吡啶誘導(dǎo)劑和二氮氯圜的合成方法在3中描述過(guò)。抗氧化劑（亞諾抗氧化添加劑、6-已氧基二氫2，2，4-三甲基喹啉、VE、6-甲基-3-已基-3-羥基吡啶）由E.B.Burlakova和L.A.Vakulov

6、a提供。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做了三到四次。表中的數(shù)據(jù)代表了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。結(jié)果和討論 首先，我們研究了向生物合成番茄紅素的發(fā)酵培養(yǎng)皿中加入刺激劑的最佳時(shí)間。在以前的實(shí)驗(yàn)中，三孢布拉氏霉菌的生長(zhǎng)和在已用培養(yǎng)基中生物合成番茄紅素的動(dòng)力學(xué)已經(jīng)研究。三孢布拉氏霉菌的生物量在培養(yǎng)的第46-53h停止。到這個(gè)時(shí)間，菌絲體的合成量已經(jīng)大約為-胡蘿卜素在繁殖期最后合成量的一半。-胡蘿卜素最強(qiáng)烈的合成期為第二到第三天，并且生長(zhǎng)過(guò)程強(qiáng)度有一個(gè)大的增長(zhǎng)。 在含有2%的葵花子油的玉米-大豆培養(yǎng)基中三孢布拉氏霉菌和-胡蘿卜素?cái)?shù)量的動(dòng)態(tài)（1）生物量；（2）-胡蘿卜素根據(jù)在4，6中的數(shù)據(jù)，生物合成番茄紅素的刺激劑是2-氨基吡啶。這種

7、復(fù)合物在生長(zhǎng)的29h，46h，53h，77h加入到三孢布拉氏霉菌培養(yǎng)基中，闡明加入刺激劑的最佳時(shí)間。表1 三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素中加入2-氨基吡啶的時(shí)間的作用注：C標(biāo)準(zhǔn)；E試驗(yàn)；下標(biāo)代表2-氨基吡啶的加入時(shí)間；所有的試驗(yàn)都做96h。 在培養(yǎng)的第53h向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入生物合成番茄紅素的刺激劑，得到這種類(lèi)胡蘿卜素的最高產(chǎn)率（表1）。數(shù)據(jù)在表一中顯示，首先，在二氨基吡啶的作用下三孢布拉氏霉菌最強(qiáng)烈的生長(zhǎng)菌絲與成熟的菌絲相比，合成了相當(dāng)小數(shù)量的番茄紅素。其次，與控制條件相比這種刺激劑輕微的抑制了幼小菌絲的生長(zhǎng)和類(lèi)胡蘿卜素（番茄紅素和-胡蘿卜素）的生物合成。同時(shí)，在加入二氨基吡啶的條件下由菌絲

8、體轉(zhuǎn)換為染色相（46h），從而生物合成類(lèi)胡蘿卜素的量有所增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種生物調(diào)節(jié)劑不僅改變了類(lèi)胡蘿卜素的組成，增加了番茄合成的生物合成，而且刺激了這種菌絲體在一定生長(zhǎng)階段生物合成番茄紅素。表2 三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素中吡啶的作用注：在加入吡啶誘導(dǎo)物的菌絲體中胡蘿卜素和番茄紅素的含量 各種吡啶誘導(dǎo)物對(duì)生物合成番茄紅素的作用的研究證明了吡啶雜環(huán)的化學(xué)作用（表2）。因此甲基群的介入雙倍的提高了番茄紅素的產(chǎn)率。在6位置上多一個(gè)甲基對(duì)番茄紅素的生物合成無(wú)效。在4位上的第三個(gè)甲基使二氮陸環(huán)的集中減少了一半，這種變體提供了集中力。在吡啶雜環(huán)上的一個(gè)氨基介入也可雙倍的減少這種刺激劑的集中。然而,

9、取代氨基在雜環(huán)上的位置有顯著的作用（與2-和4-氨基吡啶相比）。在三孢布拉氏霉菌生物合成番茄紅素中2，6-氨基吡啶最為有效。 在吡啶雜環(huán)上含有氨基和甲基的（特別是在2和6位置）吡啶誘導(dǎo)劑對(duì)生物合成番茄紅素有顯著的刺激。在這種情況下，生物合成胡蘿卜素的阻凝劑的集中會(huì)減少十倍。以前，報(bào)道在雜環(huán)上的苯甲酰、N-氧化物、乙炔基或者在或位置上引入第二個(gè)雜環(huán)對(duì)番茄紅素的生物合成無(wú)效。哌啶氫氧化物（1g/l）與2-氨基吡啶的刺激作用相當(dāng)。 向上面所說(shuō)的，除了取代吡啶外，許多三烴基銨氯化物刺激誘導(dǎo)番茄紅素的生物合成；然而，它們作用的機(jī)理還不清楚。盡管它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，這些復(fù)合物還是被認(rèn)為阻止了番茄紅素的環(huán)化

10、和轉(zhuǎn)化為-和-胡蘿卜素。表3 三孢布拉氏霉菌生物合成類(lèi)胡蘿卜素中DPA和PD的作用（菌絲體生長(zhǎng)的第5天）菌絲體在含有0.05%酵母的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；培養(yǎng)24h后加入DPA 0.7×10-4M。CP-胡蘿卜素（八氫番茄紅素和六氫番茄紅素）的無(wú)色前體。 在吡啶的誘導(dǎo)作用下，特別是6-甲基-2氨基吡啶，由三孢布拉氏霉菌合成類(lèi)胡蘿卜素的分析顯示了生物合成的誘導(dǎo)劑不僅是番茄紅素，而且是鏈孢紅素和-胡蘿卜素和八氫番茄紅素和六氫番茄紅素?zé)o色前體的誘導(dǎo)劑（表3）。在PD作用下合成類(lèi)胡蘿卜素總的數(shù)量比在檢驗(yàn)下高。 在PD作用下由三孢布拉氏霉菌菌絲體合成多烯烴的數(shù)據(jù)顯示這些復(fù)合物不僅刺激了胡蘿卜素前體，包

11、括無(wú)色的前體，而且阻止了脫氫酶。在這些考慮下，PD的作用類(lèi)似于二苯胺的作用（表3），他阻止了-胡蘿卜素的生物合成，并且刺激鏈孢紅素、無(wú)色多烯和類(lèi)胡蘿卜素前體。因此，PD刺激番茄紅素和多烯烴（八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、鏈孢紅素和八氫番茄紅素等等），PD抑制環(huán)化酶和脫氫酶，特別是移動(dòng)了氫原子使八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)榘藲浞鸭t素。為了闡明PD對(duì)生物合成類(lèi)胡蘿卜素酶的作用機(jī)理，這些抑制劑的水平，特別是6-甲基-2氨基吡啶，應(yīng)該說(shuō)明操作過(guò)程。我們研究了放線(xiàn)酮和防線(xiàn)菌D，生物合成蛋白質(zhì)和核酸的抑制劑，特別是轉(zhuǎn)化和復(fù)制。向加入了生物合成番茄紅素刺激劑的三孢布拉氏霉菌中加入放線(xiàn)酮（50l/ml）,顯著抑制了番茄

12、紅素的生物合成（PD作用下7060l/ml，加入放線(xiàn)酮后234.2l/ml）。表明，放線(xiàn)酮抑制了-胡蘿卜素的生物合成，但是使番茄紅素增長(zhǎng)3-4倍。表4 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡蘿卜素和番茄紅素中CHI和AD的作用注：C-5353h 的菌絲體，C-7777h的菌絲體；C-53+CHI-C-77在培養(yǎng)53h后加入CHI中生長(zhǎng)。在其它試驗(yàn)中，在培養(yǎng)53h后加入6-甲基-2-氨基吡啶或AD。AD(20g/ml)產(chǎn)生了不同的作用，這種核酸的抑制劑也抵抗PD的作用抑制了番茄紅素的生物合成，但是比CHI更少，實(shí)際上不影響-胡蘿卜素的產(chǎn)率。然而在有PD存在時(shí)AD對(duì)生物合成-胡蘿卜素的抑制能力更顯著（表4）。

13、這些數(shù)據(jù)表明，PD影響生物合成蛋白質(zhì)是在轉(zhuǎn)化水平。考慮CHI高的集中，我們提出OD可能抑制基因調(diào)控了生物合成番茄紅素的特定酶的生物合成。因此，獲得的結(jié)果顯示PD不僅抑制胡蘿卜素-合成酶的生物合成，而且刺激番茄紅素合成酶的從頭合成。在有PD的情況下，合成類(lèi)胡蘿卜素的數(shù)量要高些，并且番茄紅素的數(shù)量要高100倍。在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中-胡蘿卜素的數(shù)量沒(méi)有變，與向菌絲體中加PD前-胡蘿卜素的含量是相當(dāng)?shù)摹？紤]到最后的假定，番茄紅素含量在有CHI和PD的情況下與只有CHI相比的輕微增加，值得考慮。這個(gè)現(xiàn)象可解釋為，三孢布拉氏霉菌的細(xì)胞質(zhì)和核糖體結(jié)合膜的不同蛋白質(zhì)合成作用，或者由于CHI在膜組織中mRNA的部分穩(wěn)

14、定。表4中的結(jié)果顯示AD在復(fù)制水平上抑制番茄紅素的生物合成，而PD部分釋放AD的抑制能力。有趣的是與-胡蘿卜素相比，番茄紅素的生物合成中AD抑制的復(fù)制產(chǎn)生了更顯著的作用。加AD后在三孢布拉氏霉菌中番茄紅素的產(chǎn)率的降低可能與AD部分抑制轉(zhuǎn)化有關(guān)，這個(gè)在14中描述過(guò)。氮雜-和5-鹵素的吡啶誘導(dǎo)劑基質(zhì)被認(rèn)為是抑制核酸的生物合成。許多復(fù)合物，例如：葉酸，消除這些吡啶誘導(dǎo)劑的作用。表5 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡蘿卜素和番茄紅素中5-嗅尿嘧啶（0.05g/l）的作用注：5-BU5-嗅尿嘧啶。表5中的結(jié)果顯示，在有PD的條件下，核酸生物合成的抑制劑對(duì)-胡蘿卜素和番茄紅素的生物合成無(wú)效，但是降低了類(lèi)胡蘿卜素

15、的產(chǎn)率嗅尿嘧啶最有效。這個(gè)符合物抑制了酶的生物合成，可能是依靠DNA的RNA聚合酶2，從而影響蛋白質(zhì)和環(huán)化酶的從頭合成。與催化脫氫酶的作用相比，番茄紅素成環(huán)為-和-胡蘿卜素是一個(gè)敏感的氧化反應(yīng)8。因此，我們假設(shè)一定的氧化物能調(diào)節(jié)番茄紅素環(huán)化為-胡蘿卜素。表6 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡蘿卜素和番茄紅素中抗氧化劑的作用注：MEHP6-甲基-3-已基-3-羥基吡啶。抗氧化劑假如的最終濃度為0.1g/l。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們研究了各種各樣的氧化物（AO），例如：VE，甲氯喹啉，亞諾抗氧化添加劑和6-甲基-3-已基-3-羥基吡啶（MEHP），把這些加入培養(yǎng)基中抵消生物合成番茄紅素的刺激劑（表6）。6

16、-已氧基二氫2，2，4-三甲基喹啉、亞諾抗氧化添加劑和VE抑制了生物合成番茄紅素。利用MEHP獲得的結(jié)果不同；這個(gè)氧化物，根據(jù)以前獲得的數(shù)據(jù)5，與上述的氧化物截然不同，能夠刺激真菌的生長(zhǎng)，對(duì)類(lèi)脂物膜產(chǎn)生抗氧化作用，它的性質(zhì)與天然真菌抗氧化物相近。在加入PD后加入MEHP，它增加合成類(lèi)胡蘿卜素的總產(chǎn)率，并且刺激生物合成番茄紅素。MEHP的加入是為了對(duì)在PD作用下生物合成番茄紅素產(chǎn)生一種額外的作用。MEHP對(duì)生物合成-胡蘿卜素也產(chǎn)生一種額外的作用；然而，這個(gè)刺激作用對(duì)生物合成番茄紅素不是很顯著。在這次工作中，我們研究了吡啶誘導(dǎo)劑對(duì)生物合成番茄紅素的作用，并揭示了最顯著的刺激作用與氨基和甲基組出現(xiàn)在

17、吡啶雜環(huán)2位置的關(guān)系。獲得了PD刺激作用機(jī)理的數(shù)據(jù)。這些復(fù)合物，特別是2-氨基-6-甲基吡啶增加番茄紅素和多烯烴（鏈孢紅素和八氫番茄紅素、六氫番茄紅素）的產(chǎn)率。這些讓我們假定PD不僅抑制番茄紅素環(huán)化酶環(huán)化成-胡蘿卜素，而且影響類(lèi)胡蘿卜素脫氫的作用，例如，影響脫氫酶。用生物合成蛋白質(zhì)和核酸的抑制劑發(fā)現(xiàn)PD很可能作用在核糖體mPNA轉(zhuǎn)化水平上?？紤]到這些，PD與-紫羅酮、三孢酸和VA相似。加如氧化劑，特別是MEHP，增加生物合成番茄紅素，然而允許我們假定在三孢布拉氏霉菌番茄紅素的生物作用。-胡蘿卜素是三孢酸、異宗配合的真菌激素苛爾蒙的前體，因此，它通過(guò)受精卵形成，著手性的重建。在培養(yǎng)基中引入中毒的PD可能會(huì)導(dǎo)致一個(gè)應(yīng)力。在這種情況下，生長(zhǎng)和重新產(chǎn)生的過(guò)程會(huì)很快阻止7，可能是由于番茄紅素替代-胡蘿卜素的生物合成。我們假定生物合成番茄紅素由抑制和刺激環(huán)化酶的從頭合成來(lái)調(diào)節(jié)，特別是由加入相應(yīng)的氧化物提供的脫氫酶。表7 由含有三孢布拉氏霉菌的碳水化合物生物合成番茄紅素中，刺激劑的作用注：C053h的菌絲體；C170h的菌絲體；C1+6-M-2-AP在培養(yǎng)53h后加入刺激劑的70h菌絲體；C2+6-M-2-AP在培養(yǎng)53h后加入刺激劑的84h菌絲體；C284h的菌絲體；