κ阿片受體激動對血管緊張素Ⅱ誘導心肌肥大的抑制作用

1、阿片受體激動對血管緊張素誘導心肌肥大的抑制作用作者：張偉，王洪新，吳國強，劉杰 【摘要】 目的 通過觀察阿片受體激動對血管緊張素II誘導心肌肥大的作用，研究阿片受體激動劑對血管緊張素II誘導心肌肥大的抑制作用。方法 以體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞為模型，應用血管緊張素II1 M誘導心肌肥大，觀察U50488H1 M對它的作用，并和洛沙坦（los）1 M組做對比觀察阿片受體的激活對心肌肥大的作用。用Lowry法檢測心肌細胞蛋白含量；用消化分離法及計算機圖像分析系統(tǒng)檢測心肌細胞體積；用3H-leueine摻入法測定心肌細胞蛋白的合成。結(jié)果 AngII1 M使心肌細胞總蛋白含量，蛋白表達及細胞體積明顯增

2、加；U50488H1 M能夠降低由AngII引起的心肌細胞蛋白含量，蛋白表達，以及體積的增加，從而抑制心肌肥大，并且抑制程度與los1 M相似。結(jié)論 阿片受體激動劑U50488H能夠抑制由AngII誘導的心肌細胞肥大。 【關(guān)鍵詞】 心肌肥大 阿片受體 U50488H 血管緊張素II Abstract: Objective To demonstrate the inhibitory effect of -Opioid on AngII-induced hypertrophy in cultured myocardial cells of neonatal rats. Methods Based

3、on the model of cardiac bistiocyte cells in vitro culture, the experiment applies the angiotensin II1 M to induce the myocardium to be hypertrophy. Compared with the group of (los) 1 M, the experiment observes the effects of the activation of -Opioid on myocardial hypertrophy. The protein content wa

4、s measured by Lowry?s method. The protein synthetic rate was obtained through measuring the incorporation of 3H-leueine into myocyte protein by liquid scintillation method，the cardiomyocytes volumes were measured by computer photograph analysis system; the proteinic compound of the cardiac bistiocyt

5、e?s was measured by the incorporation method of 3H-leueine. Results AngII (1 M) can increase the overall protein content, proteinemia expression, and the cells? volumes. U50488H1 M can reduce the protein content of cardiac bistiocyte, protein expression and the cells? volumes, which are induced by A

6、ngII. Therefore, U50488H1 M inhibits the myocardial hypertrophy and it has the similar inhibitive extent with the los1 M. Conclusions -Opioid receptor stimulation U50488H can inhibit hypertrophy induced by AngII in neonatal rat ventricular myocytes. Key words：myocardial hypertrophy; -Opioid; U50488H

7、; Angiotersin II 心肌組織上存在阿片受體（-OR）1，近年來關(guān)于-OR對心肌細胞生長和肥厚的研究較多，本實驗室的研究也已經(jīng)證實-OR是心肌細胞的負性調(diào)節(jié)因子2可以抑制去甲腎上腺素誘導的心肌肥大3, 并表明選擇性-OR激動劑U50488H通過激活-OR與1-交互作用抑制Iso誘導的心肌細胞肥大4。血管緊張素II（angiotensin II，AngII）是一種多肽類激素，它對腎上腺、肝、腎及血管等多種器官和組織均有作用。而且也已有研究證明心肌組織上也存在著血管緊張素受體1（AT1）1438，心肌細胞也是AngII的重要靶器官，很多研究已經(jīng)證明AngII能夠誘導心肌細胞肥大。也已有

8、文獻報道，內(nèi)源性阿片肽與腎素-血管緊張素（RAS）系統(tǒng)有關(guān)5,6。因此為了進一步探索-OR激動劑與Ang誘導心肌肥大的關(guān)系，本實驗在Ang誘導心肌肥大的基礎(chǔ)上，重點觀察選擇性-OR激動劑U50488H及選擇性-OR阻斷劑-nor-BNI（norbinaltorphimine）對Ang誘導心肌肥大的作用。 1 材料與方法 1.1 實驗動物、藥品與試劑 出生后23 天的SD大鼠，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)基、選擇性受體激動劑(U50488H)及特異性受體拮抗劑（nor-BNI）、 angiotensin 、洛沙坦(los)、SD

9、S均購自Sigma公司；考馬斯亮藍購自上海生工。其他試劑均為分析純。 1.2 乳大鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 在無菌條件下，取生后13 d的SD大鼠心臟，放入D-Hanks液沖洗3 次后，剪成約1 mm3 mm的小碎塊，用0.8 g?L-1胰蛋白酶消化分離細胞，向分離的細胞中加入15的小牛血清，84的DMEM培養(yǎng)基， 1的雙抗液(含110 U?L-1青霉素,100 g鏈霉素)的培養(yǎng)基，及0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿苷（主要抑制成纖維細胞的生長），吹打均勻后以5109?L-1 的密度接種于24孔培養(yǎng)板，送入通以0.05 CO2及0.95空氣的二氧化碳孵箱中培養(yǎng)。 1.3 分組及給藥方法 常規(guī)培養(yǎng)心

10、肌細胞2 天后，為了減少血清中的成分對實驗結(jié)果的影響，更換含0.4小牛血清的培養(yǎng)基及各種濃度的試劑。設(shè)為對照組，其他組分別加入AngII 1 M；AngII 1 M +los 1 M；AngII 1 M+U50488H 1 M；AngII 1 M+U50488H 1 M+nor-BNI 1 M。給藥48 h后進行各指標的測定。1.4 培養(yǎng)心肌細胞蛋白質(zhì)含量的測定 吸去培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)基，用D-Hanks液快速沖洗3 次后，加入10g?L-1SDS 0.5 mL溶解細胞，根據(jù)計數(shù)，每孔細胞數(shù)約為5105個，Lowry等7方法測定每孔細胞蛋白質(zhì)含量。 1.5 培養(yǎng)心肌細胞體積的測定 細胞體積是通

11、過測量細胞直徑獲得的，用D-Hanks液快速沖洗長滿細胞的培養(yǎng)孔3 次，每孔加0.3 mL/（g?L）胰蛋白酶，放入37 恒溫箱中30 min后，再加入0.2 mL含有體積分數(shù)為0.1血清的培養(yǎng)基終止消化，收集細胞注入一細胞室內(nèi)（該細胞室底部是一經(jīng)硅化的蓋玻片，以防心肌細胞貼壁），在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察其中的細胞，幾乎均呈球形。用計算機CIAS大恒細胞圖象分析系統(tǒng)測量單個細胞的直徑，進而計算出細胞的體積。每孔隨機選擇4個視野，每個視野測20 個細胞。 1.6 培養(yǎng)心肌細胞蛋白質(zhì)合成的測定 培養(yǎng)48 h后更換含有37TBq?L-1 3H- 亮氨酸及各種濃度試劑的培養(yǎng)基，一起培養(yǎng)72 h

12、后倒掉培養(yǎng)液，用冷D-Hanks液快速洗3遍，每孔加入1 mL 10 g?L-1 SDS溶解細胞，應用49型玻璃纖維濾膜過濾，之后用2 mL三氯醋酸（0.2 kg?L-1）沉淀蛋白，2 mL體積分數(shù)0.950.99乙醇抽濾，烘干濾膜，用液閃儀（Paclard，Tricard2200 CA，美國）測量3H- 亮氨酸的結(jié)合，進行蛋白質(zhì)合成的分析。根據(jù)計數(shù)，每孔的細胞數(shù)大致為5104個，實驗結(jié)果以每孔的cpm值計算。 1.7 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)標準差(s) 表示，采用單因素方差分析及LSD法進行統(tǒng)計學處理。 2 結(jié)果 2.1 不同處理因素對心肌細胞蛋白含量的影響 表1的數(shù)據(jù)顯示，與對照組相

13、比，AngII組心肌細胞蛋白含量增加了54%；與AngII組相比，AngII+los、AngII+U50488H組的心肌細胞蛋白含量均降低，分別降低了37%、35%，表明U50488H和洛沙坦均能抑制AngII誘導的心肌細胞蛋白含量的增加，且U50488H的抑制作用與los的作用相似；AngII+U50488H+nor-BNI組的蛋白含量與AngII組相比未見明顯變化，表明nor-BNI可以完全抑制U50488H的作用。 表1 不同處理因素對心肌細胞蛋白含量的影響（略） 不同處理因素作用于心肌細胞48 h，?P 0.01,與正常組比較；#P 0.05, 與AngII組比較；P 0.01 與An

14、gII組比較2.2 不同處理因素對心肌細胞體積的影響 表2的結(jié)果顯示，與對照組相比，AngII組心肌細胞體積增大了84%；與AngII組相比，AngII+los、AngII+U50488H組的心肌細胞體積均減小，分別減小了51%、48%，表明U50488H和洛沙坦均能抑制AngII誘導的心肌細胞體積的增大，且U50488H的抑制作用與 los的作用相似；AngII+U50488H+nor-BNI組的細胞體積與AngII組相比未見明顯變化，表明nor-BNI可以完全抑制U50488H的作用。 表2 不同處理因素對心肌細胞體積的影響（略） ?P 0.01, 與正常組比較；#P 0.01, 與Ang

15、II組比較;P 0.01，與AngII組比較 2.3 不同處理因素對心肌細胞蛋白合成的影響 表3顯示，與對照組相比，AngII組心肌細胞蛋白合成增加了32% ；與AngII組相比，AngII+los、AngII+U50488H組的心肌細胞蛋白合成均降低，分別降低了24%、 22% 表明U50488H和洛沙坦均能抑制AngII誘導的心肌細胞蛋白合成的增加，且U50488H的抑制作用與los的作用相似；AngII+U50488H+nor-BNI組的蛋白合成與AngII組相比未見明顯變化，表明nor-BNI可以完全抑制U50488H的作用。 表3 不同處理因素對心肌細胞蛋白合成的影響（略） ?P 0

16、.01, 與正常組比較； #P 0.01 ,與AngII組比較；P 0.01 與AngII組比較 3 討論 心肌肥大是指心肌細胞增大而無細胞分裂，是對血液動力超負荷和或神經(jīng)體液刺激的適應性反應。疾病的初始階段，心肌肥厚可以通過平衡應激的增加改善心臟的功能，然而，長時間應激所致的持續(xù)性心肌肥厚最終會因心臟功能失常導致心力衰竭。目前，心肌肥厚已被公認為是猝死，心力衰竭等心血管事件強有力的獨立危險因素7，因此，探明其發(fā)生發(fā)展機制一直是心血管領(lǐng)域的重要課題8。 許多研究表明，血管緊張素II作為誘導心肌肥厚的神經(jīng)體液刺激因素之一，其絕大部分心血管效應則由屬于7次膜貫通型G蛋白偶聯(lián)受體家族中的AngII受

17、體1型（AT1）介導完成9。已有研究表明，在體外培養(yǎng)的心肌細胞中加入AngII后，可誘導心肌細胞體積增大，RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成增加，呈劑量和時間依賴性10。因此本研究采用了AngII 1 M的濃度，能夠明顯的誘導心肌細胞肥大。本實驗的結(jié)果顯示，AngII刺激心肌細胞時，蛋白合成、蛋白含量以及細胞體積均明顯增加。這些作用當用洛沙坦拮抗時可完全被抑制，證明了AngII刺激心肌細胞是通過AT1介導的。本實驗還發(fā)現(xiàn)，-OR激動劑U50488H作用于AngII誘導的心肌肥大時能夠明顯降低蛋白質(zhì)表達、含量及細胞體積的增加，并且這種作用可被選擇性-OR阻滯劑nor-BNI所阻斷。表明U50488H能夠抑制

18、AngII誘導的心肌肥大，并且還發(fā)現(xiàn)其作用和los抑制AngII誘導的心肌肥大作用相似，提示-OR與AT1之間有交互作用，這種交互作用可能是通過G蛋白偶聯(lián)受體家族實現(xiàn)的。已有研究表明，刺激阿片受體（-OR）可通過多種途徑使Ca2+i瞬變的幅度下降11-13。同時,激動心臟阿片受體后, 可激活百日咳毒素-敏感性G蛋白-磷脂酶C-三磷酸肌醇-Ca2+途徑, 使SR 中的Ca2+耗竭。在心肌細胞,U50488H也可產(chǎn)生激活K+外流的作用14, 而使動作電位的時間縮短。復極化加快將會使通過L-型Ca2+通道內(nèi)流的Ca2+減少, 并導致SR 對Ca2+回攝的降低, 使Ca2+i瞬變的幅度進一步下降。以上

19、這些機制都造成了細胞內(nèi)鈣釋放及Ca2+i濃度的下降, 從而抑制了心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展。然而AngII刺激心肌細胞肥大時也刺激Ca2+的釋放，對Ca2+的內(nèi)流也有影響，因此U50488H對AngII誘導心肌細胞肥大的抑制作用也可能是通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)來實現(xiàn)的。 本實驗研究結(jié)果雖然表明了阿片受體激動對AngII誘導的心肌肥大有抑制作用，但是阿片肽直接調(diào)節(jié)AngII的程度是很難說清楚的。因為交感神經(jīng)在血流動力學障礙時引起的作用是很復雜的；血流動力學障礙時，阿片肽對AngII的作用也是很復雜的15，所以U50488H具體通過何種信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮它對AngII的抑制作用還不甚清楚。有待進一步的探

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