人類(lèi)免疫缺陷病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

1、人類(lèi)免疫缺陷病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展    【關(guān)鍵詞】  人類(lèi)免疫缺陷病毒  檢測(cè)技術(shù)  艾滋病         人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）檢測(cè)的主要目的是用于獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）即艾滋病的病原體診斷。本文就近年來(lái)HIV檢測(cè)的研究進(jìn)展綜述如下。         1抗原檢測(cè)     &#

2、160;   常用的HIV抗原檢測(cè)是24抗原技術(shù)。機(jī)體感染HIV后，P24抗原是最早能從血清中檢出的病原學(xué)標(biāo)志，通常感染后約23周即可檢出，12月左右進(jìn)入抗原高峰期，然后隨著HIV抗體的產(chǎn)生形成抗原抗體復(fù)合物。由于抗體的中和作用，P24抗原濃度不斷下降直至難以測(cè)出的水平時(shí)，標(biāo)志著HIV感染者進(jìn)入無(wú)癥狀期。當(dāng)HIV抗原再度在血清中增長(zhǎng)，意味著病毒的大量繁殖和免疫系統(tǒng)的破壞，提示感染者已經(jīng)或即將進(jìn)入艾滋病發(fā)作期。因此，HIV P24抗原檢測(cè)主要是作為HIV抗體檢測(cè)窗口期的輔助診斷。其他新的抗原檢測(cè)方法有：免疫復(fù)合物裂解檢測(cè)法。超敏感酶免疫測(cè)定法。免疫吸附電鏡

3、法。線性免疫酶測(cè)定和羅奎爾艾滋病酵素免疫法。熒光聯(lián)結(jié)抗原定量法。         2抗體檢測(cè)         常用的HIV抗體檢測(cè)技術(shù)包括初篩試驗(yàn)和確證試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光法、金免疫滲濾實(shí)驗(yàn)、快速檢測(cè)和明膠顆粒凝集試驗(yàn)僅作為篩查試驗(yàn)，免疫印跡試驗(yàn)、條帶免疫實(shí)驗(yàn)、放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)作為確認(rèn)試驗(yàn)。         2.1 HIV抗體初篩試驗(yàn)

4、        2.1.1 ELISA適用于大批量標(biāo)本的檢測(cè)，目前是大、中、小型醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室篩查HIV抗體的主要技術(shù)手段。ELISA的基本原理是將待測(cè)抗原或抗體先固定于固相載體表面，再用酶標(biāo)記的抗原或抗體與已被固定的相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，加入酶底物及色原后呈色，呈色程度用吸光度（A）值表示，所測(cè)A值與待測(cè)抗體或抗原的水平呈相關(guān)關(guān)系，讀取結(jié)果需要用酶聯(lián)檢測(cè)儀。作為檢測(cè)HIV抗體的最主要方法,其試劑在經(jīng)過(guò)了第1代、第2代、第3代后,已經(jīng)發(fā)展到第4代檢測(cè)試劑1，2。目前使用第4代酶免法測(cè)HIV抗體試劑，敏

5、感度幾乎為100%，特異性在98.1%99.8%之間。由此可見(jiàn)，提高敏感性、特異性，縮短窗口期和簡(jiǎn)便快捷是HIV檢測(cè)試劑未來(lái)發(fā)展的主要趨勢(shì)。         2.1.2 免疫熒光法(IFA)  其原理是用H9或HUT 78培養(yǎng)細(xì)胞作為載體，用HIV感染細(xì)胞。該細(xì)胞內(nèi)就會(huì)含有HIV抗原，將HIV感染的淋巴細(xì)胞涂于玻片上，固定，制備為抗原片，加入待檢血清，待檢血清中的HIV抗體與抗原結(jié)合后，再與熒光素標(biāo)記的抗人Ig結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)有黃綠色熒光。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)

6、便、敏感性高、特異性比ELISA法高。但缺點(diǎn)是非特異熒光較難去除，所以只能用于HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn),陽(yáng)性結(jié)果還需要確證實(shí)驗(yàn)證實(shí)。            2.1.3 金免疫滲濾實(shí)驗(yàn)(GIFA)GIFA是以酶作標(biāo)記物和以膠體金為標(biāo)記物用于快速檢測(cè)艾滋病毒抗體的滲濾實(shí)驗(yàn)。其方法是將膠體金標(biāo)記技術(shù)與快速免疫斑點(diǎn)結(jié)合技術(shù)相結(jié)合，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，使抗原抗體反應(yīng)在固相上迅速完成，然后用膠體金標(biāo)記的SPA直接顯色。這些方法具有快速簡(jiǎn)單、不用儀器、目測(cè)觀察結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)

7、，在臨床檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。         2.1.4 快速檢測(cè)(RT) HIV抗體快速檢測(cè)試劑是以膠體金或硒為標(biāo)記物，硝酸纖維素膜為載體，采用層析形式進(jìn)行固相免疫測(cè)定的技術(shù)為原理制備的。該類(lèi)試劑敏感性較酶聯(lián)免疫試劑低，其使用范圍受到一定限制。但該類(lèi)試劑比較穩(wěn)定，可以在室溫下保存一年或更長(zhǎng)的時(shí)間，且操作簡(jiǎn)單，不需要儀器設(shè)備,尤其適用于單份標(biāo)本的測(cè)定?？焖贆z測(cè)試劑一般在1030min內(nèi)測(cè)出結(jié)果。         2.1.

8、5 明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)  該方法原理是將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢標(biāo)本混勻后在室溫下作用，當(dāng)待檢標(biāo)本含有HIV抗體時(shí)，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng),根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝聚情況判讀結(jié)果。它的代表方法有以下幾種：(1)斑點(diǎn)EIA。(2)斑點(diǎn)免疫膠體金(或膠體硒)快速試驗(yàn)。(3)艾滋病唾液檢測(cè)卡。(4)尿液HIV檢測(cè)卡。(5)濾紙干血片法。         2.2 HIV抗體確認(rèn)試驗(yàn)      &#

9、160;  2.2.1 WB  免疫印跡或免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)是在DNA印跡術(shù)發(fā)展而來(lái)的新型免疫生化板術(shù)，WB是將HIV病毒蛋白通過(guò)SDS  PAGE把分子量大小不等的蛋白帶分離開(kāi)來(lái)，再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素薄膜上均含有經(jīng)電泳分離過(guò)的HIV病毒抗原。待檢血清樣本用稀釋液稀100倍，將其加到硝酸纖維素膜上，恒溫震蕩，使其充分接觸反應(yīng)。血清中若含有抗HIV，就會(huì)與膜上的抗原結(jié)合，沖洗掉多余的抗體，然后加入抗人IgG酶結(jié)合物并溫育,洗滌后加入底物，有反應(yīng)的抗原抗體結(jié)合帶呈現(xiàn)紫褐色

10、，根據(jù)出現(xiàn)條帶情況來(lái)判斷結(jié)果。          2.2.2 條帶免疫試驗(yàn)條帶免疫試驗(yàn)的原理及操作方法與WB基本相同，區(qū)別在于條膜的來(lái)源和組成不同。該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)抗干擾強(qiáng)，特異性高，克服了WB實(shí)驗(yàn)中使用病毒裂解產(chǎn)物可能產(chǎn)生的同相載體上某些重要抗原不足。唯一缺點(diǎn)是合成抗原不能糖基化，它的立體構(gòu)象與天然抗原有一定差異，在某種程度上影響了HIV抗原檢測(cè)抗體的能力。           &

11、#160;2.2.3 放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)本法是將病毒的蛋白與待測(cè)血清混合,如有HIV抗體，則同位素標(biāo)記的HIV蛋白與之結(jié)合產(chǎn)生沉淀，沉淀物用配套的緩沖液和十二烷基硫酸(SDS)洗脫,即可將病毒抗原分離，最后病毒蛋白用放射自顯影鑒定,同時(shí)用已知的分子標(biāo)記物比較。此方法敏感性和特異性比WB實(shí)驗(yàn)方法高,但費(fèi)時(shí)且技術(shù)難度大，目前難以普及推廣。        3CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)         計(jì)數(shù)CD4+和CD

12、8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，是以細(xì)胞內(nèi)P24抗原作為標(biāo)志，運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì)P24抗原陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。人體感染了HIV后，其主要病理過(guò)程是免疫系統(tǒng)的損害，主要表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞的丟失，絕對(duì)數(shù)量的減少,同時(shí)CD8+細(xì)胞數(shù)量增加，使CD4+和CD8+的比例失調(diào)。隨著CD4+數(shù)量的減少，患者逐漸產(chǎn)生各種癥狀,機(jī)會(huì)性感染和腫瘤的發(fā)病率也大為增加。CD4+的數(shù)量變化與AIDS患者的死亡率密切相關(guān)，CD4+數(shù)量越低,患者存活的時(shí)間越短。CD4+也是藥物及各種療法的有效考核指標(biāo)，任何藥物或療法只要在治療8周后使患者的CD4+數(shù)量每微升外周血增加50個(gè)以上判為有效,否則判為無(wú)效。但由于CD4+和CD8+不是特異性

13、的，如腫瘤患者、先天性免疫缺陷等均可造成CD4+數(shù)量降低和CD4+/CD8+比例失調(diào)。另一方面由于人體免疫功能受多種因素影響,健康人CD4+和CD8+的數(shù)量范圍較寬，以及CD4+、CD8+本身檢測(cè)結(jié)果有一定誤差，使結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性受到一定限制。         4核酸檢測(cè)         4.1 原位雜交本法是應(yīng)用特定的標(biāo)記探針以分子雜交法直接檢測(cè)標(biāo)本中的HIV病毒靶核酸，標(biāo)記探針有放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記等。這些方法

14、陽(yáng)性率比聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)稍低，隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)，原位雜交探針技術(shù)也失去了其應(yīng)用價(jià)值。         4.2 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)目前有兩種方法用于HIV感染的檢查：(1)PCR DNA用于擴(kuò)增前病毒DNA以診斷HIV的感染；(2)PCR RNA用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT PCR)法可檢出血漿中HIV基因組的存在。         4.3 定量PCR檢測(cè)病毒載量目前常用的HIV

15、0;RNA定量測(cè)定(病毒載量測(cè)定)方法有逆轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)(RT PCR)、核酸序列擴(kuò)增試驗(yàn)(NASBA)、分枝DNA雜交試驗(yàn)(bDNA)。HIV RNA PCR定量檢測(cè)，敏感性為95%98%，假陽(yáng)性率為2%9%，特異性取決于病毒載量，在急性HIV感染時(shí)敏感性為100%，特異性為97%，當(dāng)在病毒載量大于105拷貝/毫升時(shí)特異性為100%。核酸檢測(cè)技術(shù)主要用于被高度懷疑有原發(fā)感染，且經(jīng)抗體檢測(cè)之后抗體檢測(cè)陰性或不確定時(shí)；有高危行為史或暴露史，特別是伴有相應(yīng)的臨床表現(xiàn)時(shí)，用核酸檢測(cè)進(jìn)行輔助診斷。早期診斷主要用于個(gè)體檢測(cè)、血液篩查、性病門(mén)診患者篩查、HIV陽(yáng)性產(chǎn)婦的嬰兒診

16、斷。            4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(FQ PCR)  本實(shí)驗(yàn)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。國(guó)外使用基于熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的核酸檢測(cè)系統(tǒng)(NAT)，同時(shí)檢測(cè)乙型肝炎與丙型肝炎病毒和HIV-1核酸，對(duì)于血清學(xué)檢查陰性的獻(xiàn)血員進(jìn)行篩查，以彌補(bǔ)窗口期造成的漏檢。       

17、0; 5 基因芯片技術(shù)         HIV病毒的基因芯片將PCR技術(shù)與核酸分子雜交完美結(jié)合，通過(guò)對(duì)HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標(biāo)，可以直接對(duì)病毒病原體進(jìn)行檢測(cè)，極大地提高了診斷的準(zhǔn)確性。目前應(yīng)用DNA芯片技術(shù)在艾滋病患者出現(xiàn)抗體反應(yīng)前檢測(cè)HIV，對(duì)艾滋病的早期診斷有十分重要的意義。基因芯片的發(fā)展包括以下幾個(gè)方面應(yīng)用：(1)單鏈DNA片段芯片的應(yīng)用。(2)單核苷酸多態(tài)性芯片的應(yīng)用。(3)比較基因組雜交的應(yīng)用。(4)基因表達(dá)譜檢測(cè)應(yīng)用。(5)疾病診斷基因芯片應(yīng)用。 

18、0;       綜上所述，第4代ELISA試劑的研制成功,在縮短“窗口期”，提高檢測(cè)敏感性方面有良好的應(yīng)用前景。核酸技術(shù)的應(yīng)用和CD4+T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)用于AIDS患者的療效觀察是標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。生物芯片技術(shù)作為PCR技術(shù)后的下一次革命性技術(shù)突破，將會(huì)給HIV檢測(cè)帶來(lái)一個(gè)新的發(fā)展方向。 參 考 文 獻(xiàn) 1M ylonakis E, palionM, Lally M, et al. Laboratory testing for infection with the human immunodeficiency virus: established and novel approachesJ. Am J Med, 2000, 109 (7): 568-576. 2Weber B, Berger A, Rabenau H, et al. Ev