關于組蛋白高乙?；閷У腅gr

1、關于組蛋白高乙?；閷У腅gr-1結合促進gdnf基因高轉錄膠質細胞系源性神經營養(yǎng)因子(GNDF)是一種新型的神經營養(yǎng)因子，屬于轉化生長因子-(TGF-)超家族成員，在胚胎發(fā)育過程中的表達量迅速上調，至成年期維持在較低程度。由于GDNF對多巴胺能神經元特異的營養(yǎng)作用，一直作為治療帕金森病的潛在藥物而備受關注。最近的研究說明，GDNF還是膠質瘤細胞強有力的促增殖因子，它在膠質瘤細胞中的表達量顯著高于正常膠質細胞，并且可以促進膠質瘤細胞的遷移。目前，有關GDNF對膠質瘤細胞促增殖和遷移機制的研究很多，但是對于gdnf基因高轉錄的發(fā)活力制卻知之甚少。基因的異常高轉錄通常與基因突變以及表觀遺傳學改變有

2、關。我們前期的研究發(fā)現，膠質瘤細胞中gdnf基因的異常高轉錄與基因突變無關，而與該基因啟動子II區(qū)組蛋白H3K9的高乙?；揎椨嘘P。諸多的研究已說明，啟動子區(qū)組蛋白的高乙?；揎椏梢允乖搮^(qū)域染色質中的核小體呈排列松散的開放狀態(tài)，從而利于轉錄因子與之的結合，進而促進基因的轉錄。近來的研究發(fā)現，gdnf基因啟動子II區(qū)轉錄起始位點上游(-186 bp)存在3個連續(xù)且高度保守的轉錄因子Egr-1的結合序列，且Egr-1參與了膠質細胞中成纖維細胞生長因子和丙咪嗪誘導的gdnf轉錄激活。由此我們推測，膠質瘤細胞中gdnf基因啟動子II區(qū)組蛋白高乙?；赡芤陨咿D錄因子Egr-1與之結合才能的方式引發(fā)該基

3、因的異常高轉錄。為了驗證以上假說，我們以大鼠C6星形膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞為研究對象，利用染色質免疫共沉淀(ChIP)的方法檢測了以上兩種細胞中gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點區(qū)域H3K9的乙酰化程度以及Egr-1與之的結合才能;通過組蛋白乙?；?HAT)抑制劑Curcumin和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑TSA16建立的gdnf基因啟動子II區(qū)乙?；淖兊腃6膠質瘤細胞模型，檢驗了gdnf基因啟動子區(qū)Egr-1結合位點區(qū)域組蛋白乙?；揎棾潭取gr-1與之的結合才能以及該基因轉錄程度之間是否存在必然的聯(lián)絡。1 材料和方法1.1 主要試劑大鼠C6星形膠質瘤細胞株和正常

4、星形膠質細胞為本實驗室凍存。 DMEM/F12培養(yǎng)基胎牛血清購自美國Gibco，ChIP級兔源抗乙?；M蛋白H3(Lys9)多克隆抗體(貨號07-352)、EZ-ChIP試劑盒購自Millipore，兔源抗Egr-1多克隆抗體(貨號sc-110X)購自Santa Cruz，Curcumin、TSA 和二甲基亞砜(DMSO)均購自 Sigma-Aldrich，TRIzol 購自 Invitrogen，Prime ScriptTMII 逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII 試劑盒購自大連TaKaRa。1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理將實驗室凍存的大鼠正常星形膠質細胞和C6膠質瘤細胞

5、復蘇于含有10%胎牛血清(美國Gibco)的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)的培養(yǎng)液中，置于37 ，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每兩天換1次液。取23代生長良好的大鼠C6星形膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞用于后續(xù)試驗。將處于對數生長期的C6膠質瘤細胞，以1105/ml細胞濃度接種于六孔板，每孔2 ml。待細胞生長至80%集合度時，將培養(yǎng)液更改為含有0.5%牛血清白蛋白(美國Sigma-Aldrich)的無血清Opti-MEM(美國Invitrogen)，在一樣條件下培養(yǎng)24 h。然后再更換為含有TrichostatinA(終濃度為200 nmol/ L)或Curcumin(終濃

6、度為50 mol/L)(均購自美國Sigma-Aldrich)的新穎無血清 Opti-MEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24h，其中對照組添加等體積的溶劑DMSO。1.3 ChIP-PCR染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗使用兔抗乙?；疕3K9抗體、兔抗Egr-1多克隆抗體和正常兔源 IgG，按EZ-ChIP chromatin immunoprecipitation kit 說明書的步驟操作。ChIP實驗后，采用real-time PCR的方法檢測目的抗體免疫沉淀下來的DNA。PCR反響體系為：12.5 l SYBR Premix Ex TaqTMII;上下游引物(F：5CGAGGAGGTGCAGAGT

7、GAGG3， R： 5GGGAG-CAAGAGCACGCAA 310 mol/L)各 1 l 以及 DNA模板3 加滅菌消毒的雙蒸水補充至總體積25 l。用三步法PCR反響程序(預變性：95 2 min;PCR反響：95 15 s，60 30 s，72 20 s，共40個循環(huán))進展擴增。PCR產物大小為283 bp。Real-time PCR后采用2-Ct法對數據進展相對定量，以%Input的形式計算結果：%Input =2(CtInput-CtChIP)Input dilution factor100。Real-time PCR引物由康成生物(上海)公司合成。1.4 Real-time PC

8、R采用TRIzol(Invitrogen)一步法從細胞中提取總RNA，以1 g 總RNA為模板按Prime ScriptTMII逆轉錄試劑盒說明行逆轉錄反響合成cDNA第一鏈。利用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒在反響體系(20 l)下進展實時定量PCR：SYBR Premix ExTaqTMII 10 l、上下游引物(10 mol/L)各0.5 l、cDNA模板1 l和無核酶水8 l。通過LightCycler480 熒光定量 PCR 系統(tǒng)(Roche)進展實時熒光定量分析。反響條件設置如下：95 預變性30 s;95 變性20 s，60 退火15 s;72 延伸15 s，

9、擴增40個循環(huán)。通過溶解曲線分析PCR產物特異性。每個樣品以gapdh基因的mRNA表達作為內參照，通過相對定量(2-CT)法計算目的基因在各樣品中相對mRNA的表達程度。靶基因和內參基因擴增的上下游引物序列見表1。1.5 統(tǒng)計學分析所有數據均采用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進展處理，計量資料以均數標準差表示。其中，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析。取P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 超聲斷裂染色質后DNA的電泳結果大鼠C6膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞經超聲破碎染色質后各取20 l直接進展解交聯(lián)和純化 2%瓊脂2.2 大鼠C6膠質瘤細胞和正常星形

10、膠質細胞中gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點處H3K9的乙?；潭菴hIP-PCR結果顯示：大鼠C6膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中gdnf基因啟動子II區(qū)的組蛋白H3K9均發(fā)生了不同程度的乙?；揎?。與正常星形膠質細胞相比，C6膠質瘤細胞中gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點區(qū)域組蛋白H3K9的乙?；潭葮O顯著升高(P0.01，圖2)。2.3 大鼠C6膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中Egr-1與gdnf基因啟動子II區(qū)的結合情況ChIP-PCR結果顯示：C6膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中轉錄因子Egr-1都可以不同程度地與gdnf基因啟動子II區(qū)潛在的Egr-1結合位點區(qū)域結合。與

11、正常星形膠質細胞相比，C6膠質瘤細胞中Egr-1與gdnf基因啟動子II區(qū)的結合量極顯著升高(P0.01，圖3)。2.4 大鼠C6膠質瘤細胞中gdnf基因啟動子II區(qū)H3K9乙?；揎椊閷У腅gr-1與之的結合才能調節(jié)該基因的轉錄我們采用Curcumin和TSA的藥物處理建立了gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點處乙?；潭雀淖兊腃6膠質瘤細胞模型，即50 mol/L Curcumin處理24 h后，顯著降低了gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點處H3K9的乙酰化程度;相反的，200 nmol/LTSA處理24 h后，顯著進步gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點處H3K9的乙

12、?；潭?圖4A)。在此根底上，采用ChIP-PCR和real-time PCR技術檢測了gdnf基因啟動子II區(qū)H3K9乙?；揎椄淖儗gr-1與之的結合才能及該基因轉錄程度的影響。結果顯示，gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點處H3K9低乙酰化修飾，減少Egr-1與之的結合的同時，降低了gdnf mRNA的表達(P而且，gdnf 基因啟動子 II 區(qū) Egr-1 結合位點處H3K9高乙?；揎?，在促進Egr-1與之結合的同時，進步了gdnf mRNA的表達(P0.05，圖4B，C)。3 討論Egr-1是gdnf基因活化的關鍵轉錄因子。為了探明gdnf基因啟動子II區(qū)組蛋白H3K9高

13、乙?；揎棿龠M該基因高轉錄的作用機制，我們利用ChIP-PCR的方法檢測了大鼠C6星形膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中該啟動子區(qū)Egr-1結合位點區(qū)域組蛋白H3K9的乙?；癄顟B(tài)。K9是組蛋白H3調節(jié)基因轉錄激活最為活潑的乙?；稽c。結果顯示，C6膠質瘤細胞中gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1靶向區(qū)域發(fā)生了組蛋白H3K9的高乙?；揎?圖2)，與我們之前的研究結果相似，說明組蛋白H3K9高乙?；揎椏赡苡绊懙紼gr-1與gdnf基因啟動子II區(qū)的結合。為了驗證以上推測，我們利用ChIP-PCR的方法檢測了大鼠C6星形膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中Egr-1與gdnf基因啟動子II區(qū)潛在的結合位點的

14、結合情況，發(fā)現C6膠質瘤細胞中Egr-1可以與gdnf基因啟動子II區(qū)潛在的結合位點結合，并且較之正常膠質細胞Egr-1的結合量顯著升高(圖3)，與我們的推測相一致。此外，Shin 等人發(fā)現缺失Egr-1結合位點顯著下調了gdnf基因啟動子II區(qū)的啟動活性，說明Egr-1的結合可以促進gdnf基因的轉錄活性。由此，我們提出本文的假說，gdnf基因啟動子II區(qū)組蛋白高乙?；閷У腅gr-1與之結合量的升高促進了C6膠質瘤細胞中該基因的高轉錄。為了進一步證實以上假說，我們利用以往的實驗結果挑選了Curcumin和TSA處理C6膠質瘤細胞的最正確作用時間及作用濃度，并在此根底上建立了gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點乙?；淖兊腃6膠質瘤細胞模型。發(fā)現，Egr-1呈組蛋白H3K9乙?；蕾嚨姆绞浇Y合到gdnf啟動子II區(qū)，并且促進了gdnf基因的轉錄，與我們的預期相符(圖4)。綜上所述，本研究發(fā)現了大鼠C6星形膠質瘤細胞中，gdnf基因啟動子II區(qū)Egr-1結合位點區(qū)域組蛋白H3K9發(fā)生了高乙?；揎?，并且Egr-1與之的結合才能也顯著升高(Pgdnf基因的轉錄程度以及Egr-1與該基因啟動子的結合才能，都隨著Egr-1