氧化砷誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡線粒體形態(tài)改變

1、氧化砷誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡線粒體形態(tài)改變【摘要】目的通過(guò)研究食管癌細(xì)胞株SHEEC1細(xì)胞凋亡早期線粒體的形態(tài)改變和bcl-2、bax的表達(dá)，以了解三氧化二砷（As2O3）作用于食管癌細(xì)胞的機(jī)制。方法食管癌細(xì)胞株SHEEC1用1、2、3 mol/L As2O3作用2、4、6、12、24 h。用Annexin-V 熒光探針，流式細(xì)胞儀和DNA組方檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞；光鏡和電鏡檢測(cè)凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；用羅達(dá)明（Rhodamin 123）熒光探針檢查活細(xì)胞線粒體的改變；用免疫組織化學(xué)SP方法檢查bcl-2和bax的表達(dá)。結(jié)果SHEEC1細(xì)胞經(jīng)As2O3作用24 h出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)改變。4 h可用A

2、nnexin-V查出早期凋亡細(xì)胞。線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變?nèi)缦拢篈s2O3作用24 h內(nèi)線粒體增生，伴有電子密度高物質(zhì)出現(xiàn)在基質(zhì)，是早期細(xì)胞損傷的現(xiàn)象。作用6 h線粒體進(jìn)行性腫脹，12 h出現(xiàn)氣球樣外觀，甚至外膜破裂。不同劑量皆引起損傷脫落細(xì)胞bcl-2表達(dá)下調(diào)和bax上調(diào)。結(jié)論由As2O3誘導(dǎo)的SHEEC1細(xì)胞凋亡，線粒體形態(tài)改變是早期改變，細(xì)胞凋亡和bax表達(dá)上調(diào)及bcl-2表達(dá)下調(diào)有密切關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】食管腫瘤；脫噬作用；線粒體；原致癌基因蛋白質(zhì)c-bcl-2；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的Morphological changes of mitochondria in apoptosis of esop

3、hageal carcinoma cells induced by As2O3SHEN Zhongying, SHEN Jian, CHEN Minghua, LI Qiaoshan，HONG Chaoqun. Department of Pathology, Shantou University Medical College, Shantou 515031，China【Abstract】ObjectiveIn order to make clear how As2O3 targets the cells of esophageal carcinoma, the morphology of

4、mitochondria and expression of bcl-2bax were selected to study the SHEEC1 cell line during early apoptosis. MethodsThe esophageal carcinoma cell line SHEEC1 was treated by As2O3 with concentrations of 1, 2 and 3 mol/L for the periods of 2, 4, 6, 12 and 24 h. Annexin-V-Fluorescein and DNA histogram w

5、ere used to detect the early apoptotic cells by flow cytometry. The morphologic changes of the apoptotic cells were examined by means of light and electron microscopy. Changes in mitochondria of living cells were detected with Rhodamin 123 fluorescent probe by fluorescent microscopy. The expression

6、of bcl-2 and bax in floating cells were determined by immunohistochemical procedures. ResultsTypical apoptotic morphological changes were found in SHEEC1 at 24 h after As2O3 treatment. Cells in the early stage of apoptosis were detected by Annexin-V labeled at 4 h. The ultrastructural alterations of

7、 mitochondria were found as following: within 4 h after administrating As2O3, mitochondrial hyperplasia with small electron-dense materials in its matrix was the earliest manifestation of cell injury. At 6 h progressive mitochondrial swelling lead to balloon-like appearance and its outer membrane di

8、srupted at 12 h. In all groups, down regulated expression of bcl-2 and over expression of bax were always found in damaged cells. ConclusionIn the SHEEC1 cell line morphological changes of mitochondria are the early events in apoptosis induced by As2O3 and apoptosis is closely related to over expres

9、sion of bax and down-regulating expression of bcl-2. It is possible that As2O3 is a mitochondriotoxic anticancer agent for esophageal carcinoma.【Key words】Esophageal neoplasms；Apoptosis；Mitochondria；Proto-oncogene protein c-bcl-2；Tumor cells, cultured近年來(lái)用三氧化二砷（As2O3）治療急性白血病已引起人們的重視1，2。其治療機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

10、3，4。我們?cè)鴪?bào)道As2O3誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，主要表現(xiàn)在細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)改變5，6。最近我們發(fā)現(xiàn)As2O3誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體的改變7。我們擬通過(guò)研究As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的早期改變，重點(diǎn)在線粒體的形態(tài)改變及bcl-2、bax的表達(dá)，以闡明As2O3引起食管癌細(xì)胞凋亡的作用點(diǎn)，并證實(shí)As2O3是一種線粒體毒性藥物。材料與方法1細(xì)胞系和用藥方法：食管癌細(xì)胞系SHEEC1是我室用HPV18 E6E7和TPA 協(xié)同誘導(dǎo)胚胎食管上皮惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞8，在M199培養(yǎng)基中加10小牛血清培養(yǎng)傳代。As2O3（Sigma公司產(chǎn)品， Lot A1010）用培養(yǎng)基配成1、2、3 mol/L。用藥方法：細(xì)胞

11、培養(yǎng)在250 ml培養(yǎng)瓶和24孔塑料培養(yǎng)板（Corning 公司產(chǎn)品），內(nèi)置蓋玻片，每孔接種細(xì)胞5104個(gè)，分1、2、3 mol/L 3濃度As2O3組及1組對(duì)照，在第2、4、6、12、24 h取標(biāo)本檢查。2透射電鏡檢查：收獲細(xì)胞離心成團(tuán)，2.5戊二醛固定，常規(guī)電鏡制樣，日立H-300電鏡檢查。3流式細(xì)胞儀檢查：DNA倍體測(cè)定按常規(guī)制樣，碘化丙錠（propidium iodide ，PI）染色，檢查細(xì)胞周期和凋亡峰。Annexin V 檢測(cè)：取培養(yǎng)細(xì)胞106用PBS洗，200 r/min離心5 min。Annexin-V-Fluos標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Boehringer Mannheim公司，按試

12、劑盒方法作活細(xì)胞染色。流式細(xì)胞儀（FACSort，B-D公司）檢測(cè)。4羅達(dá)明123 (Rhodamin123，Rho123）熒光探針標(biāo)記：Rho123， MW 381 ，Molecular Probes公司產(chǎn)品。細(xì)胞在24孔板蓋玻片上生長(zhǎng)。1、2、3 mol/L As2O3作用，定時(shí)取片，PBS洗滌，Rho123（10 g/ml）染色，在37， 5 CO2培養(yǎng)箱溫育30 min，PBS洗3次，在落射熒光顯微鏡（Nikon Fluophot）下檢查，激發(fā)光505 nm，發(fā)射光534 nm。5免疫組織化學(xué)檢查：用細(xì)胞離心機(jī)（Cytospin ,美國(guó)Shandon 公司）收集脫落細(xì)胞，4多聚甲醛固定

13、。bcl-2、bax兔抗人多克隆抗體及SP免疫組織化學(xué)試劑盒（Santa Cruz公司產(chǎn)品）購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司，按試劑盒操作方法，并設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。脫落細(xì)胞另作蘇木素細(xì)胞核染色。結(jié)果1凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變：SHEEC1加不同濃度As2O3后24 h均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，多數(shù)細(xì)胞核染色質(zhì)凝集靠邊呈典型凋亡細(xì)胞核改變（1）。2細(xì)胞凋亡的指標(biāo)：1 mol/L As2O3作用早期凋亡細(xì)胞較少，As2O3 2 mol/L作用4 h Annexin V顯示早期凋亡細(xì)胞占7.1%。DNA組方顯示細(xì)胞凋亡峰，12 h凋亡細(xì)胞7.5，24 h凋亡細(xì)胞 35.0。3 mol/L As2O3作用細(xì)胞易進(jìn)入凋亡后期改

14、變。3線粒體Rho 123熒光標(biāo)記：加藥后2 h線粒體數(shù)目增加， 4 h出現(xiàn)有粗大線粒體，多在胞質(zhì)外帶（2）。12 h及24 h線粒體外形結(jié)構(gòu)不清。4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變：不同濃度As2O3作用后24 h，線粒體數(shù)目增多，大小不一，橢圓形、雙層膜和內(nèi)嵴清晰（3），有的線粒體腫脹，內(nèi)嵴減少縮短，有電子密度高的不定形物質(zhì)沉淀，細(xì)胞核染色質(zhì)開(kāi)始凝集（4）。 作用6 h可見(jiàn)線粒體腫脹，嵴消失；12 h外膜消失，基質(zhì)透明呈氣球樣，并可見(jiàn)自噬泡。核染色質(zhì)凝集成塊及開(kāi)始靠近核膜（5），作用24 h細(xì)胞皺縮，核變圓，染色質(zhì)凝集靠邊，出現(xiàn)凋亡的改變（6）。1 mol/L As2O3作用，病變發(fā)展較慢，而3 mol/

15、L As2O3作用病變發(fā)展較快，病變發(fā)生時(shí)間縮短。5bcl-2和bax的表達(dá)：不同濃度As2O3作用2、6、12、24 h時(shí)收集細(xì)胞，bcl-2蛋白產(chǎn)物免疫組織化學(xué)檢測(cè)呈陰性（7），bax蛋白產(chǎn)物免疫組織化學(xué)染色呈深褐色，為高度表達(dá)（8）。討論細(xì)胞凋亡是一個(gè)發(fā)展的過(guò)程，有其早、中、晚期的改變，不同濃度的As2O3作用于SHEEC1細(xì)胞系46 h時(shí)出現(xiàn)凋亡早期改變：形態(tài)學(xué)上細(xì)胞完整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核染色質(zhì)輕度凝集，線粒體增多，腫脹，基質(zhì)有致密物質(zhì)沉積，有溶酶體自噬泡。Annexin-V染色流式細(xì)胞儀檢查，證實(shí)磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外露。Rho123 熒光探針顯

16、示在凋亡早期線粒體增生和腫脹。3 mol/L As2O3作用24 h凋亡細(xì)胞出現(xiàn)晚期改變：多數(shù)細(xì)胞死亡，出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡改變，如細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核變圓，染色質(zhì)凝集靠邊，核膜不完整。線粒體空泡化或外膜破裂呈氣球狀，胞質(zhì)呈退行性變。線粒體是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸鏈、電子傳遞，三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場(chǎng)地，也是產(chǎn)生能量的場(chǎng)所，其病變影響到細(xì)胞各成分的協(xié)調(diào)并危及細(xì)胞生命活動(dòng)9。線粒體膜通透性改變和跨膜電位改變使線粒體腫脹，位于線粒體內(nèi)外膜間隙的細(xì)胞色素c進(jìn)入胞質(zhì)，激活某些蛋白酶系統(tǒng)（caspases）10，是凋亡產(chǎn)生的起源。細(xì)胞核改變是核酸酶進(jìn)入核內(nèi)使染色質(zhì)致密化和DNA斷裂11。Rh

17、o123是一種分子探針，屬于慢反應(yīng)膜電位熒光探針，用以檢測(cè)線粒體內(nèi)側(cè)負(fù)電荷。它不但可以顯示線粒體的形態(tài)，也可通過(guò)線粒體內(nèi)熒光強(qiáng)度的改變，計(jì)算膜電位的增減，反映線粒體膜的通透性，是研究線粒體形態(tài)和功能的良好試劑。我們多次檢查不同濃度As2O3 作用于食管癌細(xì)胞系造成的損傷細(xì)胞，皆出現(xiàn)bcl-2表達(dá)下調(diào)和bax表達(dá)增加，證實(shí)這兩者參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程。bcl-2可以預(yù)防細(xì)胞凋亡12，bax能促進(jìn)線粒體膜通透性改變，使細(xì)胞色素c釋放引起細(xì)胞凋亡13。bcl-2/bax互相拮抗，其作用位置在線粒體，兩者皆為細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)基因。1SHEEC1細(xì)胞加2 mol As2O3 作用24 h出現(xiàn)多數(shù)凋亡細(xì)胞,細(xì)

18、胞皺縮,細(xì)胞核變圓, 變小,染色質(zhì)凝集成塊,靠邊蘇木素4002SHEEC1細(xì)胞加2 molAs2O3 作用4 h活細(xì)胞Rhodamin熒光探針象。左側(cè)細(xì)胞線粒體增多,腫大,右側(cè)改變不明顯Rho1231 0003SHEEC1細(xì)胞加2 mol As2O3 作用 6 h像出現(xiàn)線粒體增多,分布不均,大小不一,膜結(jié)構(gòu)和嵴保存，細(xì)胞核染色質(zhì)未見(jiàn)凝集 15 0004密集線粒體輕度腫脹, 結(jié)構(gòu)模糊，周?chē)?xì)胞質(zhì)電子密度增加20 0005SHEEC1細(xì)胞加2 mol As2O3作用6 h，線粒體腫大,內(nèi)嵴消失,有的剩單層膜, 呈氣球狀,核染色質(zhì)凝集15 0006同上,24 h,細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，染色質(zhì)連結(jié)成塊, 靠邊

19、，胞質(zhì)線粒體增多、變性7 0007As2O3作用6 h,損傷脫落細(xì)胞，bcl-2呈陰性SP法4008同上，bax染色細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)陽(yáng)性SP法400砷等氧化劑也作用在線粒體的膜轉(zhuǎn)移電位，產(chǎn)生過(guò)量H2O2產(chǎn)物，使膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用和線粒體腫脹。我們研究證明As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，線粒體在藥物作用4 h內(nèi)即開(kāi)始發(fā)生改變。核的改變晚于12 h。As2O3引起氧化應(yīng)激（oxidative stress ）毒性作用可能是通過(guò)線粒體膜通透性和膜電位改變，也可使bcl-2和bax表達(dá)異常而產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。因此認(rèn)為As2O3具有線粒體毒性，可用于治療食管癌。作者單位：沈忠英(515031 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究室)沈

20、健(515031 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究室)參考文獻(xiàn)1孫鴻德，馬玲，胡曉晨，等. 癌靈1號(hào)結(jié)合中醫(yī)辯證治療急性早幼粒細(xì)胞白血病32例. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,1992,12:170-171.2Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with dow

21、nregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins. Blood, 1996,88:1052-1061.3Look AT. Arsenic and apoptosis in the treatment of acute promyelocytic leukemia. J Natl Cancer Inst, 1998,90:86-88.4Shao W, Fanelli M, Ferrara FF, et al. Arsenic trioxide as an inducer of apoptosi

22、s and loss of PML/RAR alpha protein in acute promyelocytic leukemia cells. J Natl Cancer Inst, 1998, 90:124-133.5沈忠英,譚立軍,蔡維佳，等. 氧化砷誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究. 華人消化雜志, 1998,6:226-229.6Shen ZY, Tan LJ, Cai WJ, et al. Arsenic trioxide induces apoptosis of oesophageal carcinoma in vitro. Int J Mol Med, 1999,4:3

23、3-37.7Shen ZY, Shen J, Cai WJ, et al. The alteration of mitochondria is an early event of arsenic trioxide induced apoptosis in esophageal carcinoma cells.Int J Mol Med, 2000,5:155-158.8沈忠英,蔡維佳,沈健，等. HPV18E6E7誘發(fā)人胚食管上皮永生化和TPA 協(xié)同誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化的研究. 病毒學(xué)學(xué)報(bào),1999,15:1-7.9Kunz-Schughart LA, Habbersett RC, Freyer JP. Mitochondrial function in oncogene-transfected rat fibroblasts isolated from multicellular