玻璃器皿的清洗包扎、培養(yǎng)基的制備及滅菌

1、實驗八實驗八 玻璃器皿的清洗包扎，玻璃器皿的清洗包扎， 培養(yǎng)基的配制及滅菌培養(yǎng)基的配制及滅菌一、目的要求一、目的要求 o1、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培養(yǎng)皿的包扎方法；和培養(yǎng)皿的包扎方法；o2、掌握培養(yǎng)基的制備原理和方法；、掌握培養(yǎng)基的制備原理和方法；o3、掌握干燥滅菌、濕熱滅菌的原理和方法。、掌握干燥滅菌、濕熱滅菌的原理和方法。二、基本原理二、基本原理（一）實驗室中使用的玻璃器皿簡介（一）實驗室中使用的玻璃器皿簡介 微生物學實驗所用的玻璃器皿，大多要進行消毒、滅菌和用微生物學實驗所用的玻璃器皿，大多要進行消毒、滅菌和用來培養(yǎng)微生物，因此對其質

2、量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。來培養(yǎng)微生物，因此對其質量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。玻璃器皿的質量一般要求玻璃器皿的質量一般要求硬質玻璃硬質玻璃，才能承受高溫和短暫灼燒而，才能承受高溫和短暫灼燒而不致破壞；玻璃器皿的不致破壞；玻璃器皿的游離堿含量要少游離堿含量要少，否則會影響培養(yǎng)基的酸，否則會影響培養(yǎng)基的酸堿度；對玻璃器皿的堿度；對玻璃器皿的性狀和包裝方法的要求性狀和包裝方法的要求，以能防止污染雜菌，以能防止污染雜菌為準；為準；洗滌洗滌玻璃器皿的方法不當也會影響實驗的結果。目前微生玻璃器皿的方法不當也會影響實驗的結果。目前微生物學實驗室中，有些玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、吸管等）已被物學實驗室

3、中，有些玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、吸管等）已被一次性一次性塑料制品塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的實驗室用具。所代替，但玻璃器皿仍是重要的實驗室用具。 o清洗清洗o包裝包裝o滅菌滅菌洗滌劑、試管刷等洗滌劑、試管刷等報紙、牛皮紙、專用塑料袋或器皿等報紙、牛皮紙、專用塑料袋或器皿等干熱滅菌干熱滅菌 濕熱滅菌濕熱滅菌 紫外滅菌紫外滅菌 過濾過濾玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗器皿包扎器皿包扎二、基本原理二、基本原理（二）培養(yǎng)基簡介（二）培養(yǎng)基簡介 培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養(yǎng)基質，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各代謝產物的營養(yǎng)基質，用以培養(yǎng)

4、、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。種微生物或積累代謝產物。 在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。 按成分：按成分： 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基；天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基；按物理性質：按物理性質： 固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；按用途：按用途： 基礎培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基等?；A培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基等。 培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)基的成分和pH 不同種類的培養(yǎng)基中，一

5、般應含有水分、碳源、氮不同種類的培養(yǎng)基中，一般應含有水分、碳源、氮源、無機鹽和生長因子等。不同微生物對源、無機鹽和生長因子等。不同微生物對pH要求不一要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細一般是偏酸性的，而細菌和放線菌培養(yǎng)基的菌和放線菌培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性的（嗜堿一般為中性或微堿性的（嗜堿細菌和嗜酸細菌例外）。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據細菌和嗜酸細菌例外）。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據不同微生物的要求將培養(yǎng)基的不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調到合適的范圍。調到合適的范圍。 配制培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的原則是什的原則是什么？么？ 根據菌種與用途而選擇和

6、配制培養(yǎng)基。根據菌種與用途而選擇和配制培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基的配制見實驗書附錄常用培養(yǎng)基的配制見實驗書附錄 P241 o實驗室常用的滅菌方法有干熱滅菌法、高壓蒸汽滅菌法、實驗室常用的滅菌方法有干熱滅菌法、高壓蒸汽滅菌法、紫外線照射法和微孔濾膜法等。紫外線照射法和微孔濾膜法等。o干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌是利用高溫使微生物細胞內的干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。o紫外線殺菌機制主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的紫外線殺菌機制主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復

7、制。的復制。o過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌的方法。過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌的方法。 （三）滅菌的常用方法和基本原理（三）滅菌的常用方法和基本原理 高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從

8、而使沸點增高，得到高于器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度。導的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。 紫外線滅菌是用紫外線燈進行的，波長為紫外線滅菌是用紫外線燈進行的，波長為200300nm的紫外的紫外線都有殺菌能力，其中以線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機制主要是紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機制主要是因為它誘導了因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了的形成，從而抑制了DN

9、A的復制。另一的復制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O，再使，再使O2氧化生成臭氧氧化生成臭氧（O3）或使水（）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（）氧化生成過氧化氫（H2O2），），O3和和H2O2均有均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室、接種箱、手術只適用于無菌室、接種箱、手術室內的空氣及物體表面的滅菌室內的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過。紫外線燈距照射物以不超過12m為為宜。宜。 此外，為了加強紫外線滅菌效果，在打開紫外線燈此外，為了加強紫外線滅菌效果，在打開紫外線燈以前，可在無菌室

10、內（或接種箱內）噴灑以前，可在無菌室內（或接種箱內）噴灑35的石的石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細菌。無菌室內的桌面，凳另一方面也可以殺死一部分細菌。無菌室內的桌面，凳子可用子可用23的來蘇爾擦洗，然后再開紫外線燈照射，的來蘇爾擦洗，然后再開紫外線燈照射，即可增強殺菌效果，達到滅菌目的。即可增強殺菌效果，達到滅菌目的。結合理論知識結合理論知識和生活，在使和生活，在使用紫外滅菌時用紫外滅菌時你應該注意什你應該注意什么？么？滅菌在微生物實驗操作中的重要意義滅菌在微生物實驗操作中的重要意義 在微生物實驗中，需

11、要進行在微生物實驗中，需要進行純培養(yǎng)純培養(yǎng)，不能有任何，不能有任何雜菌污染，因此對所用器材、培養(yǎng)基和工作場所都要進雜菌污染，因此對所用器材、培養(yǎng)基和工作場所都要進行嚴格的行嚴格的消毒和滅菌消毒和滅菌。消毒與滅菌不僅是從事微生物學。消毒與滅菌不僅是從事微生物學和整個生命科學研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實用技術，和整個生命科學研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實用技術，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護、食品、生物制品等各方面而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護、食品、生物制品等各方面均具有重要的應用價值。均具有重要的應用價值。 ？區(qū)別？區(qū)別？消毒消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體而言，一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體

12、而言，滅菌滅菌則是指殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，包括芽孢和孢子。則是指殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，包括芽孢和孢子。三、實驗器材三、實驗器材 o溶液和試劑：牛肉膏、蛋白胨、溶液和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaClNaCl、可溶性淀粉、可溶性淀粉、KNOKNO3 3、K K2 2HPOHPO4 43H3H2 2O O、MgSOMgSO4 47H7H2 2O O、FeSOFeSO4 47H7H2 2O O、KHKH2 2POPO4 4、葡萄糖、孟加拉紅（、葡萄糖、孟加拉紅（1%1%的水溶液）、鏈霉素的水溶液）、鏈霉素（1%1%的水溶液）、的水溶液）、1mol/L NaOH1mol/L NaOH、1mol/L H

13、Cl1mol/L HCl。o儀器和其他用品：試管、三角燒瓶、燒杯、量筒、玻璃儀器和其他用品：試管、三角燒瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、棒、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pHpH試紙（試紙（pH5.5pH5.59.09.0）、棉花、牛皮紙（或鋁箔）、）、棉花、牛皮紙（或鋁箔）、記號筆、麻繩和紗布等。記號筆、麻繩和紗布等。四、操作步驟四、操作步驟 （以配制乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為例）（以配制乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為例） 實驗教材實驗教材P246第一件事？第一件事？計算計算蛋白質蛋白質 10g牛肉膏牛肉膏 3g乳糖乳糖 5gNaCl 5g1.6%溴甲酚

14、紫溴甲酚紫 1 ml蒸餾水蒸餾水 1000 ml 6g1.8g3g3g0.6 ml200200 ml ml3 50ml 2支支 5ml 10支支1 5ml 4支支共共 3 3 150ml 150ml 1 1 40ml 40ml可先配制可先配制200ml 3200ml 3 ，分裝后，稀釋到，分裝后，稀釋到1 1，再進行分裝。再進行分裝。 四、操作步驟四、操作步驟 （以配制乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為例）（以配制乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為例） 實驗教材實驗教材P2461 1、稱量：、稱量：2 2、熔化：、熔化： 3 3、按比例加、按比例加1.6%1.6%溴甲酚紫乙醇溶液溴甲酚紫乙醇溶液 4 4、調、調pHp

15、H： 5 5、分裝：、分裝： 6 6、加塞：、加塞： 7 7、包扎：、包扎： 8 8、滅菌：、滅菌： 9 9、無菌檢查：、無菌檢查： 按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏、蛋白胨、乳按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏、蛋白胨、乳糖、糖、NaCl放入燒杯中。（牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在放入燒杯中。（牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯。也可小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。）牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取

16、出紙片。）在上述燒杯中先加入在上述燒杯中先加入少于少于所需要的水量，用玻璃棒攪所需要的水量，用玻璃棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解，或在磁力攪拌勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解，或在磁力攪拌器上加熱溶解。藥品完全溶解后，補充水到所需的總器上加熱溶解。藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積；體積； 在未調在未調pH之前，先用精密之前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中滴加入如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中滴加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其試紙測其pH，直至，直至pH達到達到7.27.4。反之，用。反之，

17、用1mol/L HCl進行調節(jié)。注意進行調節(jié)。注意pH值不要調過頭，以避免回調，否則，將會影響培養(yǎng)基內各值不要調過頭，以避免回調，否則，將會影響培養(yǎng)基內各離子的濃度。對于有些要求離子的濃度。對于有些要求pH值較精確的微生物，其值較精確的微生物，其pH的調節(jié)可用酸度計進行（使用方法，可參考有關說明書）。的調節(jié)可用酸度計進行（使用方法，可參考有關說明書）。 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入有小倒管（德漢按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入有小倒管（德漢氏小管）的試管內氏小管）的試管內 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時

18、冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期；用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期； 將上述培養(yǎng)基以將上述培養(yǎng)基以115，20min高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌。（操作演示）（操作演示） 將滅菌培養(yǎng)基放入將滅菌培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)的溫室中培養(yǎng)2448h，以，以檢查滅菌是否徹底。檢查滅菌是否徹底。 分裝分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入 試管內或三角燒瓶內。試管內或三角燒瓶內。 分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。以免沾污棉塞而引起污染。 (1)液體分裝高度以試管高度的液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。左右為宜。(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，滅菌后制成斜面，如圖如圖-2。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。(