CCK8實驗原理與步驟說課講解

1、精品文檔CCK實驗精品文檔1、在96孔板中配置100”的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24 小時(37C , 5% CO2) 2、向培養(yǎng)板加入10履不同濃度的待測物質(zhì)。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間（例如： 6、12、24或48小時）。4、向每孔加入10“ CCK8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們 會影響OD值的讀數(shù)）。5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。6、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。7、若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10屋 0.1M的HCL溶 液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。 24 小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。PS: 1%

2、 w/v SDS溶液配制方法：組份濃度：10% （W/V）SDS配制量：100ml配制方法：1 .稱量10g高純度的SDS置于100-200ml燒杯中，加入約80ml的去離子水，68 c加入溶解2 .滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.23 .將溶液定容至100ml后，室溫保存。注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換 新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的 培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更 換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可?；盍τ嬎悖杭?xì)胞活力* （%） =A（加藥）-A （空白）/A （0加藥）-A （空白）X

3、100A （加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A （空白）：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度A （0加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力CCK-8可以用于細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8,它在電子載體（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的 脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可以用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒 性分析。其使用方法在增殖和毒性試驗中有所區(qū)別： 細(xì)胞增殖試驗：1 .接種細(xì)胞懸液100微升于96孔板，預(yù)先置

4、于37度,5%CO2飽和濕度 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 .在每孔內(nèi)加入10微升的CCK-8試劑.3 .把培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱內(nèi)1-4小時（根據(jù)細(xì)胞類型其時間有所不同）4在450nm波長處測定吸光值，參比波長為600nm或以上波長.毒性分析試驗：1 .接種100微升細(xì)胞懸液（5000個/孔）于96孔板2 .預(yù)先放置37度5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時3 .加入10微升不同濃度的毒性物質(zhì)到孔內(nèi)培養(yǎng)基4 .在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時.5 .在每孔內(nèi)加入10微升CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4小時；6在450nm波長處測定吸光值，參比波長為600nm或以上.以上步驟摘自CCK-8的說明書，由于涉及到某些原因，

5、我省去了上面的一些推銷用語）（內(nèi)有標(biāo)價，1245元/1000孔）寫在前面：一直都像個新手，從未老道過。所有新手的迷茫與無奈我最能體會。看到園子里有一些同學(xué)在問有關(guān) CCK8試驗的事情，當(dāng)初我也和他們一樣，像個被蜘蛛絲纏住頭的迷茫蒼蠅一頭扎進(jìn)園子里，期待能找到些解決謎團(tuán)的只言片語。希望我寫的這些非專業(yè)文字能夠幫助那些在實驗室里沒有前行者指點迷津的筒子們。當(dāng)然仁者見仁智者見智，我 寫的只是個人實驗心得，僅供參考。歡迎大家拍磚共同進(jìn)步。實驗是 簡單的，道路是曲折的，時間就是用來浪費的，科研就是自娛自樂使 勁折騰。我沒有做過MTT實驗，但其實原理及目的都是一樣的（反應(yīng)機(jī)理不 一樣）。都說CCK8簡單點

6、而且數(shù)據(jù)更穩(wěn)定，所以就用了這個試劑盒。CCK8的說明書大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問題都有提 到。而且說明書里提供的一些關(guān)于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價 值，因為那是反復(fù)驗證過的最佳數(shù)值。但無論如何，做這個試驗一定 要摸條件。你就算再懶，這個懶不得，否則你都只是在做無用功。以 下言論全部以細(xì)胞毒性試驗為前提，如果你做的是促進(jìn)細(xì)胞生長的藥 物的藥效實驗?zāi)蔷土懋?dāng)別論了。摸條件包括1、種板數(shù)；2、種板后細(xì)胞的貼壁生長時間；3、加藥后 的孵育時間；4、CCK8試劑加入量；5、CCK8試劑加入后細(xì)胞孵育 時間。看起來很多，其實這就是一個實驗。而且都是種的空白板，也 就是不加藥物，只加細(xì)胞和 CCK

7、8。1、種板數(shù)：這個要查文獻(xiàn)，看你所用細(xì)胞別人有無做過，把范圍大 致找出。記住還要參考說明書，這個很重要。然后稀釋一系列濃度種 板。首先你要觀察多長時間細(xì)胞可貼壁完全， 一般貼壁生長24小時。 然后還有在你的實驗時間內(nèi)，不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)生長情況。比如我擬 定考察4天的時間，那么在4天內(nèi)，細(xì)胞是剛好鋪滿還是堆積生長？因為每塊板都會設(shè)置對照孔，也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基+CCK8,這個 數(shù)值是板上的最大數(shù)值，CCK8試驗最佳OD值在1.0附近，所以這 個最大數(shù)值最好能控制在1.0左右。我的實驗經(jīng)驗是不要讓細(xì)胞長滿， 一旦長滿了很難去判斷是否堆積生長了， 對藥物能否順利進(jìn)入細(xì)胞有 影響此為其一，其二生長

8、不均勻易導(dǎo)致孔間 OD值數(shù)據(jù)偏差大，而且 OD值也很大。2、貼壁生長的時間我一般就直接讓它貼壁長 24h 了，這個時間細(xì)胞 已經(jīng)貼壁完全，而且這樣設(shè)置時間對自己安排實驗時間也方便。 沒人 愿意大半夜爬起來做實驗吧。3、加藥后的孵育時間，我的實驗摸了 3個時間，24h, 48h, 72h。然 后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇 最好的時間。太長了就沒有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可 想而知了。4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積 的10%。這里有一個問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞 懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還

9、是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，CCK8 不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點文獻(xiàn)報道不一致。本人最終采用的是后 者。5、cck8試劑加入后孵育時間，隨著時間的增加，OD值就會增大?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了 0.5h、1.0h、2.0h。再說一下關(guān)于種板設(shè)置問題。眾所周知周圍一圈孔因為邊緣效應(yīng)都是 不用來做實驗的。一般每組樣品我會設(shè)置6個復(fù)孔，得到的OD值去 掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會省很多力氣， 但是也會增大組內(nèi)誤差。這個只有通過校正移液槍和選用最適槍頭 了。做這個實驗我想大家遇到的最大問題應(yīng)該是數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，組內(nèi)數(shù)據(jù)偏 差大。講了很多怎樣摸條件，其實就一個

10、原則，把 OD值控制在1.0 左右。數(shù)據(jù)不穩(wěn)定也只能通過增大樣品數(shù)，借助數(shù)據(jù)處理來彌補(bǔ)。還 有實驗操作一定要仔細(xì)小心，盡量平行操作。能力有限，表達(dá)不清的大家湊合著看看吧。有疑問的歡迎大家留言討 論，我們的目標(biāo)是共同進(jìn)步，哈哈。補(bǔ)充：謝謝大家的熱烈討論。突然想起用酶標(biāo)儀檢測的時候還有一些 細(xì)節(jié)問題，園子里也有前輩提過。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡， 就用吸耳球吹掉，氣泡會很影響檢測結(jié)果。樣品板要擦拭干凈，當(dāng)然 了，蓋子一定要記得拿掉啊補(bǔ)充說明：這幾天有同學(xué)提出了一個問題，這個問題非常好也非常關(guān) 鍵：將OD值控制在1.0這個說法是否有依據(jù)？這里我還是想提醒大家一定要認(rèn)真閱讀試劑盒的說明書，試想一個試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認(rèn)可需要經(jīng)過多少試驗反復(fù)驗證。我購買的是同仁化學(xué)研究所的 CCK8試劑盒，說明書的P7Q23: OD 值在什么范圍比較合適？答：一般情況下 OD值在0.1-2.0都可以， 在1.0附近比較好。再說到自己的實驗設(shè)計，酶標(biāo)儀的原理其實和紫外分光光度計是一樣 的，所以UV上很多減小誤差的注意事項在酶標(biāo)儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什