阿魏酸鈉抑制高糖誘導的系膜細胞增殖

1、阿魏酸鈉抑制高糖誘導的系膜細胞增殖         10-09-13 10:10:00     編輯：studa20                      作者：石明雋 羅華 肖瑛 桂華珍 郭兵 張國忠【摘要】  目的 探討阿魏酸鈉(SF)對高糖誘導的原代

2、培養(yǎng)系膜細胞(GMC)增殖的作用及其機制。方法 原代培養(yǎng)腎小球系膜細胞，分為正常組、甘露醇組、高糖組、高糖加不同濃度SF組，分別于處理后24、48 h收集細胞。用MTT法檢測細胞增殖；流式細胞術測定cyclinD1和細胞周期；免疫細胞化學檢測p53蛋白的表達。結果 48 h內(nèi)，高糖促進GMC增殖，使GMC由G1期進入S期細胞比例增高；同時cyclinD1蛋白表達上調而p53蛋白的表達減少；SF能明顯對抗高糖的這種作用，其作用隨SF濃度的增加、作用時間的延長而加強。結論 SF可能通過抑制cyclinD1蛋白表達和促進p53蛋白生成，從而抑制高糖誘導的GMC增殖。 【關鍵詞】  系膜細胞

3、；高葡萄糖；阿魏酸鈉；細胞周期；cyclinD1； p53    【Abstract】  Objective  To investigate the effects and mechanism of sodium ferulate (SF)on the proliferation of mesangial cells induced by high glucose. Methods  The primary glomerular mesangial cells were divided into normal, mannitol, h

4、igh gloucose and high gloucose plus different concentration SF groups. Cells were collected at 24 and 48 h. Cell proliferation was measured by MTT assay, and cell cycle and cyclinD1 were measured through flowcytometry. p53 protein expression was detected by immunocytochemistry. Results  High gl

5、ucose significantly promoted mesangial cell proliferation and upregulated the expression of cyclinD1, and downregulated expression of p53 within 48 h. SF inhibited mesangial cell proliferation induced by high glucose with concentration and timedepended manner.Conclusions  SF can inhibit prolife

6、ration of mesangial cells induced by high glucose by suppressing the cyclinD1 expression and increasing the level of p53 protein possibly.    【Key words】  Mesangial cells; High glucose; Sodium ferulate; CyclinD1; p53    糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機制十分復雜，至今尚未完全闡明，但顯著的高血糖和高尿糖應是引起DN

7、的始動因素和中心環(huán)節(jié)1。腎小球系膜細胞(GMC)為腎小球固有細胞，有實驗證實，高糖可刺激其活化進而增生，產(chǎn)生多種細胞因子和炎癥介質，合成并分泌細胞外基質成分，導致腎小球硬化2，3，但也有不少研究認為高糖并沒有促進GMC增殖而僅僅是肥大4，5。阿魏酸鈉(SF)是一種非肽類內(nèi)皮素拮抗劑，具有廣泛的藥理作用，已有作者用其治療DN取得良好效果6，然而其作用機制未明。本研究擬用原代培養(yǎng)GMC，觀察高糖培養(yǎng)環(huán)境中GMC細胞周期及p53和cyclinD1蛋白表達的變化以及SF對其影響，探討SF的作用機制，為臨床合理用藥提供新的實驗依據(jù)。    1  材料與方法

8、0;   1.1  主要試劑及設備  SF(吉林西點藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，批號：05020909)；甘露醇(石家莊四藥有限公司)；MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；L谷氨酰胺、4甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶(美國Sigma公司)；胎牛血清(FCS，Hyclone)；抗cyclinD1抗體、p53抗體、SABC試劑盒(武漢博士德)。CO2孵箱(美國REVCO)；倒置顯微鏡(OLYMPUS)；酶標儀(美國BioRad)；流式細胞儀(美國BD)；CM2000B型生物醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)(北航)。   

9、 1.2  方法    1.2.1  大鼠原代GMC培養(yǎng)  大鼠雙腎灌洗后，分級篩網(wǎng)濾過分離腎小球，并用型膠原酶消化處理，種植法體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞。培養(yǎng)細胞按已建立的方法鑒定7，確定為系膜細胞，供實驗用。    1.2.2  實驗分組  正常組(5.5 mmol/L D葡萄糖)；SF+正常組(SF240 mg/L5.5 mmol/L D葡萄糖)；甘露醇組(5.5 mmol/L D葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)；高糖組(30 mmol/L D葡萄糖)；SF+高糖培養(yǎng)組(S

10、F60、120、240 mg/L+30 mmol/L D葡萄糖)。各組分別于培養(yǎng)24和48 h時收集細胞用于檢測。    1.2.3  MTT法檢測系膜細胞增殖  將原代GMC分組，每組三復孔，細胞周期同步后， SF作用20 h和44 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 l，繼續(xù)作用4 h，去上清，然后每孔加入DMSO 200 l，輕微振蕩30 min，酶標儀570 nm處測光吸收值(A)。用臺盼藍染色，檢測存活細胞數(shù)。    1.2.4  流式細胞儀檢測腎小球系膜細胞的細胞周期  調整G

11、MC數(shù)為5×105個/ml，接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，加入適量的含10FCS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，孵育到亞融合狀態(tài)，改用無血清培養(yǎng)液孵育24 h，使細胞處于相對靜止期(G1期)。分別于24和48 h收集制成單細胞懸液，PBS洗滌2次，用PBS調節(jié)細胞數(shù)為1×106個/ml，分裝于6個EP管中(1 ml/管)，無水乙醇固定，加人RNA酶孵育后，流式細胞儀對細胞周期進行檢測，MCYCLE軟件分析細胞周期。    1.2.5  流式細胞儀測定cyclinDl的表達水平  按1.2.4步驟收集各組細胞，無水乙醇固定，加入0.5 ml

12、0.1% Triton X100，每組12管細胞隨機分為6管陰性對照，6管實驗組，對照組加入50 l生理鹽水代替一抗，實驗組分別加入50 l cyclinD1抗體，37震蕩水浴20 min，洗掉未結合的抗體，加入50 l FITC標記的二抗(140)，流式細胞儀測1×104個以上細胞的cyclinD1，MCYCLE軟件分析細胞的熒光強度，以平均熒光強度(MFI)表示蛋白的表達量。    1.2.6  免疫細胞化學法檢測p53蛋白表達  預先在12孔板中加入無菌玻片，向每孔中加入1 ml細胞數(shù)為1×105/ml的GMC，細胞周

13、期同步后，藥物作用24和48 h，收集爬片細胞，95%乙醇固定，山羊血清封閉，滴加p53抗體 (150)于細胞爬片，4孵育過夜，再加生物素化二抗，DAB顯色，北航CM2000B型生物醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)分析圖像。    1.3  統(tǒng)計學處理  采用SPSS10.0軟件包，計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。    2  結  果    2.1  高糖和不同濃度SF對GMC增殖的影響  與正常組比較，在高糖培養(yǎng)2

14、4和48 h，光吸收值(A)明顯增高(P0.01)，表明GMC增殖，其增殖率分別為78.7和71.4，而甘露醇組未見GMC明顯增多。不同劑量的SF組經(jīng)臺盼藍染色證實活細胞數(shù)在96%以上，表明所用劑量范圍的SF對GMC無毒性。三個劑量SF作用24 h即明顯表現(xiàn)出抑制高糖誘導的GMC增殖(P0.01)，以濃度為240 mg/L 的SF作用48 h對GMC增殖的抑制作用最強(P0.01)，而240 mg/L SF對正常濃度葡萄糖培養(yǎng)的GMC無明顯影響(見表1)。    2.2  高糖和不同濃度SF對GMC細胞周期的影響  流式細胞術檢測結果顯示，與正常組相比，高糖組G0G1期細胞比例降低，48 h后達到56.34；S期細胞比例逐漸增高，48 h后為28.64，與正常組有非常顯著差異(P0.01)。在SF處理組，隨著SF濃度的增加和作用時間的延長，G0G1期GMC比例增加，S期細胞比例下降，與高糖組相