入職培訓技巧之免疫學基礎知識篇

1、入職培訓之基礎知識篇免疫學基礎免疫學技術類型免疫平臺方法學定義：研究機體自我識別和對抗原性異物排斥反應對抗原性異物排斥反應的一門科學。 現(xiàn)代免疫的概念已不再局限于抵抗微生物感染這個范圍，它是指動物(人)機體對自身和非自身的識別，并清除非自身的大分子物質，從而保持機體內(nèi)、外環(huán)境平衡的一種生理學反應。免疫學 （immunology） 執(zhí)行這種功能的是動物(人)機體的免疫系統(tǒng)，它是機體在長期進化過程中形成的與自身內(nèi)(腫瘤)，外(微生物)敵人作斗爭的防御系統(tǒng)，從而使機體獲得特異性的免疫力，同時又能對內(nèi)部的腫瘤產(chǎn)生免疫反應而加以清除，從而維持自身穩(wěn)定。 免疫學是研究抗原性物質、機體的免疫系統(tǒng)和免疫應答的

2、規(guī)律和調(diào)節(jié)以及免疫應答的各種產(chǎn)物和各種免疫現(xiàn)象的一門生物科學，它是和醫(yī)學與醫(yī)學微生物學同時誕生的。隨著生物化學、分子生物學等學科的發(fā)展，免疫學的研究亦已進入分子水平時代，而且向其它很多學科滲透，已成為生命學科研究所不可缺少的一門學科。免疫系統(tǒng)（ immune system）： 是機體免疫功能的生理結構 ，它由免疫器官 、和免疫分子等組成.免疫器官:胸腺、淋巴結、脾免疫細胞：淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/ 巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等。免疫分子：免疫球蛋白（B 淋巴細胞在 抗原刺激下變?yōu)闈{細胞所產(chǎn)生的免疫分子抗體）、細胞因子、補體和HLA分子免疫系統(tǒng)（ immune system）定義：是機體免疫

3、系統(tǒng)對抗原刺激所產(chǎn)生的以排除抗原為目的的生理過程。這個過程是免疫系統(tǒng)各部分生理功能的綜合體現(xiàn)，包括了抗體遞呈、淋巴細胞活化、免疫分子形成及免疫效應發(fā)生等一系列的生理反應。目的是通過有效的免疫應答，機體得以維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。適應性免疫應答可分為三個階段：1.識別階段：T細胞和B細胞分別通過TCR和BCR精確識別抗原，其中T細胞識別的抗原必須由抗原提呈細胞來提呈；2.活化增殖階段：識別抗原后的淋巴細胞在協(xié)同刺激分子的參與下，發(fā)生細胞的活化、增殖、分化，產(chǎn)生效應細胞（如殺傷性T細胞）、效應分子（如抗體、細胞因子）和記憶細胞；3.效應階段：由效應細胞和效應分子清除抗原。免疫應答初次及再次免疫應答抗體產(chǎn)

4、生的一般規(guī)律初次及再次免疫應答抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律定義：能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應答，并且能夠與免疫應答產(chǎn)物(抗體或免疫效應細胞)特異性結合的物質。 抗原的兩種基本特性：1）免疫原性：指抗原分子能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應答的性質。 2）免疫反應性：指抗原分子與免疫應答產(chǎn)物發(fā)生特異性結合的性質。 抗原 （Antigen)1）根據(jù)抗原性質分類：完全抗原具有免疫原性和免疫反應性的物質； 半抗原無免疫原性，只有免疫反應性。2）根據(jù)抗原刺激B細胞產(chǎn)生抗體是否需要Th細胞輔助分類：胸腺依賴性抗原 & 胸腺非依賴性抗原3）根據(jù)抗原的來源分類：天然抗原 & 人工抗原4）根據(jù)與免疫動物的親緣關系分類： 異種抗原 & 同種

5、異型抗原 & 自身抗原抗原的類型：n 1） 異物性n 2）分子量的大小n 3）化學組成、分子結構與立體構象的復雜性 n 4）物理狀態(tài) 決定抗原性的條件 一、 定義：抗原決定簇又稱表位是指抗原性物質表面決定該抗原特異性的特殊化學基團，是免疫應答和免疫反應具有特異性的物質基礎。 由于抗原決定簇通常位于抗原分子表面，因而又稱為表位。 二、大 小 ：抗原決定簇的大小是相當恒定的，如肌紅蛋白的決定簇由67個氨基酸殘基組成，伸長約為1.92.3nm，多糖抗原決定簇由6個單糖殘基組成，大小為3.5nm;核酸的決定簇只有5個核苷酸組成，大小為2.0nm。 三、決定簇的數(shù)量： 抗原分子的抗原決定簇的數(shù)目稱為抗原

6、的抗原價。 抗原決定簇1.單價抗原只有一個決定簇的抗原 。如簡單半抗原即為單價抗原。 2.多價抗原含有多個抗原決定簇的抗原稱為多價抗原。 3.單特異性決定簇抗原分子只含有一種特異性決定簇稱為單特異性決定簇。4.多特異性決定簇含有兩種以上不同特異性的決定簇稱為多特異性決定簇。 5.功能價位于抗原分子表面能與抗體反應的抗原決定簇稱為功能價。 6.非功能價隱蔽于分子內(nèi)部的抗原決定簇稱為非功能價，經(jīng)酶消化后才暴露出來。 一、不同物種間存在共同的抗原組成 二、不同抗原分子存在共同的抗原決定簇 三、不同決定簇之間有部分結構相同 蛋白質抗原的決定簇取決于多肽末端的氨基酸組成，尤其是末端氨基酸的羧基對特異性影

7、響最大，如果末端氨基酸相似，即可出現(xiàn)交叉反應，而且交叉反應的強度與相似性成正比抗原的交叉性異種抗原：與免疫機體不同種屬的抗原，譬如各種疫苗，異種動物紅細胞，異種蛋白等。同種抗原：與免疫機體同種屬的抗原，能刺激同種而基因型不同的個體產(chǎn)生免疫應答。譬如血型抗原、同種移植物抗原等。 自身抗原：能引起自身免疫應答的自身組織成分。如在胚胎期從未與自身淋巴細胞接觸過的隔絕成分（晶狀體蛋白、腦組織等）或非隔絕成分，但在感染、藥物、燒傷、電離輻射等因素影響下構象發(fā)生改變的自身成分。 異嗜性抗原：這類抗原與種族特異性無關，存在于人、動物、植物及微生物之間性質相同的抗原。該現(xiàn)象首先由瑞典病理學家Forssman

8、發(fā)現(xiàn)的，故又稱為Forssman抗原。1、免疫球蛋白簡稱 Ig：指具有抗體活性的動物蛋白，存在于人和動物血液、組織液及其它外分泌液中的一類具有相似結構的球蛋白。免疫球蛋白普遍存在于血液、組織液及外分泌液中。 2、抗體：動物機體受到抗原物質的刺激后，由B淋巴細胞轉化為漿細胞產(chǎn)生的，能與相應抗原發(fā)生特異性結合反應的免疫球蛋白，這類免疫球蛋白稱為抗體(簡稱Ab)?？贵w（Antibody) (一)重鏈(H鏈) :重鏈大約是由420-440個氨基酸組成，分子量大約為50000-77000，兩條重鏈之間由1對或1對以上的二硫鍵(ss)互相連接。重鏈由可變區(qū)和恒定區(qū)組成；根據(jù)抗體恒定區(qū)抗原性差異，將免疫球蛋

9、白的重鏈分為5種類型、，由此決定了免疫球蛋白的類型，即 IgG、IgM、 IgA、IgE、IgD。 (二)輕鏈(L鏈) :輕鏈是由213-214個氨基酸組成，分子量約為22500。兩條相同的輕鏈其羧基端(C端)靠二硫鍵分別與兩條重鏈連接。 (三）免疫球蛋白的功能區(qū) :免疫球蛋白的多肽鏈分子可折疊成幾個由鏈內(nèi)二流鍵連接成的環(huán)狀球形結構，稱為功能區(qū)。免疫球蛋白的單體分子結構 根據(jù)抗體恒定區(qū)抗原性差異，將免疫球蛋白的重鏈分為5種類型、，由此決定了免疫球蛋白的類型，即 IgG、IgM、 IgA、IgE、IgD。五類免疫球蛋白結構示意圖抗原與抗體能夠特異性結合是基于抗原決定簇（表位）和抗體超變區(qū)分子間的

10、結構互補性與親和性。這種特性是由抗原、抗體分子空間構型所決定的。除兩者分子構型高度互補外，抗原表位和抗體超變區(qū)必須密切接觸，才有足夠的結合力。 抗原抗體反應抗原抗體反應可分為兩個階段抗原抗體反應可分為兩個階段：第一階段為抗原與抗體發(fā)生特異性結合的階段，此階段反應快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見反應；第二階段為可見反應階段，這一階段抗原抗體復合物在適當溫度、pH、電解質和補體影響下，出現(xiàn)沉淀、凝集、細胞溶解、補體結合介導的肉眼可見的反應，此階段反應慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時。在血清學反應中，以上兩階段往往不能嚴格分開，往往受反應條件（如溫度、pH、電解質、抗原抗體比例等）的影響。 特異性 即專

11、性，是抗原抗體反應最主要的特性，是由抗原決定簇與抗體分子高變區(qū)之間在空間結構上存在的互補性所決定的。這種結合的特異性，使得抗原抗體反應檢測廣泛用于對微生物感染的檢測與鑒別診斷、分子鑒定等各個領域?？乖贵w反應的主要特點特異性可逆性比例性可逆性由于抗原抗體反應是非共價結合，因此其反應是可逆的，形成的抗原抗體復合物與游離的抗原及抗體之間處于一種動態(tài)的平衡狀態(tài)；如改變?nèi)芤旱睦砘瘲l件(如鹽離子濃度、酸堿度等)，可使抗原抗體復合物完全解離。抗原抗體反應的可逆性特點可用于對抗原或抗體的分離或純化。當抗原抗體比例達到一個合適范圍時，其反應可形成肉眼可見的沉淀或凝集現(xiàn)象：而當抗體或抗原過剩時，由于均不能形成大

12、分子的免疫復合物，故沉淀物的形成相應較少，甚至無沉淀物形成。因此，在進行抗原抗體反應檢測時，須通過預實驗確定二者合適的濃度比例?？乖贵w反應的主要特點比例比例性性抗原抗體反應的主要特點免疫學基礎免疫學技術類型免疫平臺方法學1. 雙抗體夾心法2. 間接法3. 競爭法4. 捕獲法免疫檢測的技術類型原理： 用已知抗體檢測雙價或雙價以上大分子抗原。以特異性抗體包被載體表面，然后加入可能含有相應抗原的待測樣本，孵育后洗滌 ，再加酶標記的特異性抗體一起孵育。 包被抗體 、待測抗原和酶標抗體形成夾心式復合物。雙抗體夾心法用已知抗原檢測抗體用已知抗原包被固相載體， 加入待測樣本，再與酶標記的二抗進行反應 ，加

13、底物顯色。是檢測抗體最常用的方法。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。間接法原理小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點 ，因此不能用雙抗體夾心法進行測定 ，可以采用競爭法模式 。其原理是標本中的抗原 （或抗體）和一定量的酶標抗原 （或抗體 ）競爭與固相抗體（ 或抗原 ）結合 。標本中抗原量含量愈多 ，最后的顯色也愈淺。競爭法原理用抗人IgM 抗體包被固相， 以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM 抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。捕獲法原理-用已知抗體檢測抗體，主要用于IgM檢測固相載體固相載體的要求理

14、想的固相載體應與抗體（抗原）有較高的結合容量，且結合穩(wěn)定極少脫落；它可結合抗原或抗體免疫反應物，以及如親和素或鏈霉親和素等大分子蛋白質；生物大分子固相化后仍應保持活性，而且為有利于與反映充分進行，最好其活性基團朝向反應溶液；固相化方法應簡便易行，快速經(jīng)濟。免疫分析中常見術語固相載體的種類和選擇1.塑料制品 抗體或蛋白質抗原可通過非共價或物理吸附機制結合到固相載體表面。因材料經(jīng)濟、方法簡便、操作及測定易于自動化，迄今用聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應板仍是異相沒免疫測定方法最常用的固相載體2.微顆粒 此類固相載體系由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為微米（um），由于帶有能與蛋白質結合

15、功能團（如-NH2、-COOH、-OH、-CHO或-NH-NH2等），易與抗體（抗原）形成化學偶聯(lián)，且結合容量大。3.膜載體 包括硝酸纖維膜（nitrocellulose，NC）玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。免疫分析中常見術語免疫吸附劑免疫吸附劑是指與固相載體結合后的抗原或抗體，而將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating）。包被的方法依所用固相載體種類而有不同，可以是非共價健吸附，也可是共價鍵化學偶聯(lián)。目前普遍使用的聚苯乙烯固相載體（如Elisa板）即多采用吸附方式包被抗原或抗體。除固相載體的理化性質外。用抗原或抗體包被后，固相載體表面常會余少量未吸附位點，可非特異地吸附測定時加入的

16、標本和酶標記物中的蛋白質，導致本地偏高。因此需用1%-5%的牛血清白蛋白（BSA）或5%-20%的小牛血清等包被一次，消除上述干擾，此過程稱為封閉（blocking）。包被好的固相載體，加防腐緩沖液咋低溫可放置一段時間而不喪失免疫活性。免疫分析中常見術語常見標記物 1. 常用酶 辣根過氧化物酶 （HRP） 堿性磷酸酶（AP）2. 金顆粒3. 其他標記物 熒光素 吖啶酯 放射性元素等免疫分析中常見術語堿性磷酸酶（alkaline phospharase,AP） 可從大腸桿菌或小牛腸粘膜中提取，敏感性高，空白值低。不溶性底物： 硝基藍四氮唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）混

17、合液，是AP最敏感的底物，呈紫色； 堅牢紅和萘酚ASMX混合液，呈紅色AP可溶性底物 ： 一般采用對硝基苯磷酸酯（P-nitrophenyl phosphate,P-NPP），產(chǎn)物呈黃色，測定波長為405nm。免疫分析中常見術語免疫分析中常見術語底物液1. 魯米諾、異魯米諾及其衍 生物類 （HRP底物）2. 金鋼烷（1,2-二氧乙烷及其衍生物 ） AMPPD 目前市場常用底物液免疫學基礎免疫學技術類型體外診斷方法學及原理體外診斷試劑在生物領域的分屬（由醫(yī)療器械管理辦法）根據(jù)檢測原理或者檢測方法，體外診斷試劑可以分為：生化診斷試劑、免疫診斷試劑、分子診斷試劑、微生物診斷試劑、尿液診斷試劑、凝血類

18、診斷試劑、血液學和流式細胞診斷試劑等。生化、免疫和分子診斷試劑為我國診斷試劑主要的三大類品種。體外診斷試劑按檢測原理或者檢測方法分類42%33%9%6%4%6%免疫臨床化學分子血液學微生物學其他體外診斷試劑三大主流領域對比 生物化學實驗是把化學分析技術和生物化學實驗反應原理的方法應用于疾病的診斷、治療、監(jiān)控的實驗分支。實驗反應原理及分析方法理論依據(jù)目前利用酶具有催化活性這一特性，在臨床上已普遍應用測定酶蛋白，同時還可以測定三大代謝的產(chǎn)物，如糖、脂類、蛋白質、這樣也就建立起利用酶促反應的一級反應測定代謝物的方法。一級反應反應速度與底物濃度成正比，因此只有當酶反應為一級反應時，才能準確測定底物含量

19、，（如測定血糖、總甘油三脂、總膽固醇等）。從此在臨床試劑盒的方法中出現(xiàn)了以酶為試劑測定各種代謝產(chǎn)物。臨床生化試劑1. 比色法生化項目常用的技術類型2.免疫比濁法 免疫比濁法是抗原抗體結合動態(tài)測定方法?；驹恚寒斂乖c抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應而且比例合適(一般規(guī)定抗體過量)時，形成的可溶性免疫復合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應液出現(xiàn)濁度。當抗體濃度固定時，形成的免疫復合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應液的濁度也隨之增加。通過測定反應液的濁度與一系列標準品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。生化項目常用的技術類型具體見以下鏈接http:/ DH2

20、+H2O2 D+2H2O 配方顯色反應原理 HRP化學發(fā)光 (ChemiLuminescence ，簡稱為 CL) 分析法是分子發(fā)光光譜分析法中的一類，它主要是依據(jù)化學檢測體系中待測物濃度與體系的化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發(fā)光強度的檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法。（分為直接發(fā)光、間接發(fā)光和電化學發(fā)光）二、化學發(fā)光直接發(fā)光-吖啶酯標記間接發(fā)光-酶標記（HRP對應的 魯米諾系統(tǒng) ALP對應的MPPD系統(tǒng)）電化學發(fā)光化學發(fā)光常用體系吖啶酯發(fā)光雅培（）間接化學發(fā)光（化學發(fā)光酶聯(lián)免疫技術）辣根過氧化物酶-魯米諾系統(tǒng)（HRP-Luminol）堿性磷酸酶-AM

21、PPD系統(tǒng)（ALP-AMPPD）電化學發(fā)光電化學發(fā)光羅氏（roche）板式發(fā)光 -包被抗體包被在包被板上磁微粒發(fā)光-包被抗體包被在磁珠上根據(jù)包被固相載體可分為板式發(fā)光和磁微粒發(fā)光板式發(fā)光磁微粒發(fā)光試劑盒常用在免疫層析的平臺三、免疫層析平臺膠體金免疫層析技術新型免疫層析技術熒光膠乳標記免疫層析上轉磷光標記免疫層析時間分辨標記免疫層析量子點標記免疫層析納米磁珠標記免疫層析標記物穩(wěn)定性差，結果靠肉眼觀測，檢測靈敏度低，只能用于定性或半定量檢測 膠體金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一種物質中所形成的體系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶膠，用此金溶膠標記蛋白質（抗原、抗體或SPA、

22、SPG），膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標蛋白的抗原抗體結合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當這些標記物在相應的標記處大量聚集時，可在載體膜上呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點，從而用于抗原或抗體物質的半定量或定性。膠體金與ELISA不同之處便是反應時間大大縮短，僅需要數(shù)分鐘就完成了ELISA需數(shù)小時才能顯示的結果。因為在斑點免疫滲濾分析DIFA和斑點免疫層析分析DICA中，高濃度的抗體集中固定在纖維素的微孔中，待測抗原在滲濾或層析時，流經(jīng)微孔與固定的高濃度抗體緊密接觸，很快完成免疫結合反應。這就是以膜為基礎的膠體金快速免疫結合分析中的免疫濃縮作用。在ELISA中，待測抗原要在液相中經(jīng)過擴散作用，逐漸與吸附在固相表面的抗體結合。同時，標記抗體也需要同樣的擴散結合過程形成抗體-抗原-標記抗體復合物，故需時間較長。故此技術做到了名副其實的POCT。膠體金特點膠體金原理間接法為了消除待測血清標本中大量的非特異性IgG與特異性IgG競爭結合金標記抗人I