免疫共沉淀詳細(xì)順序

1、免疫共沉淀詳細(xì)步驟 實(shí)驗(yàn)原理 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互 作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋 白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beadsI 上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的proreinA就能吸附抗原達(dá)到 精制的目的。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定 I二I、/ 一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋 白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為

2、的影響；（3）可以分離得到天 然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白 質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者7i 在中間起橋梁作用；（3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗 體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。 實(shí)驗(yàn)試劑 I.RIPABuffer配制： 基礎(chǔ)成分： Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性） NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集） 精心整理 NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲(chǔ)存液） 去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用修0配制成10%儲(chǔ)存液；

3、避光保存） 注意：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實(shí)驗(yàn)時(shí)，不要加去氧膽酸鈉，因?yàn)殡x子型去污劑能夠使 酶變性，導(dǎo)致活性喪失。 RIPA蛋白酶抑制劑 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲(chǔ)存液，室溫保存） EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲(chǔ)存液，PH7.4） （/1PX，.I 亮抑酶肽（Leupeptin）（用叱0配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20C保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20C保存） .1I,” Z-_I/ 胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲(chǔ)存液，分裝，-20C保存） RIPA磷酸

4、（酯）酶抑制劑 激活的Na3VO4（用O配制成200mM的儲(chǔ)存液，見(jiàn) SodiumOrthovanadateActivationProtoco） NaF（200mM的儲(chǔ)存液，室溫保存）7i 注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，不加磷酸酯酶抑制劑 2.工作液配制： 配制100ml的modifiedRIPAbuffer: 1）稱取790mg的Tris-Base,加到75ml去離子水中，加入900mg的NaCl,攪拌,直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值至U7.4 2）加10ml10%的NP-40 3）加2.5ml10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清 4）加1m1100mM的EDTA,用量筒定容到1

5、00ml,2-8C保存5）理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時(shí)加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑各100gPMSF,Na3VO4,NaF各500p），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會(huì)降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天。 各種成分在工作液中的終濃度： Tris-HCl:50mM,pH7.4 NP-40:1% 去氧膽酸鈉：0.25% NaCl:150mM EDTA:1mM 4VrI PMSF:1mM 1 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑：各1pg/ml Na3VO4：1mM NaF:1mM I 實(shí)驗(yàn)步驟 J- 準(zhǔn)備工作：

6、 j1 預(yù)冷PBS,RIPABuffer,細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī) 1 .用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS; 2 .加入預(yù)冷的RIPABuffer（1ml/107個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶， 0.5ml/5106個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶）； 3 .用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4C, 緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）；精心整理 4.4C,14000g離心15min,立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中； 5.準(zhǔn)備ProteinAagarose,用PBS洗兩遍珠子，然后用PBS配制

7、成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠； 6.每1ml總蛋白中加入100IProtein蹶脂糖珠（50%）,4c搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景； 7.4C,14000g離心15min,將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除ProteinA珠子； I 8 .（Bradford法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1:10倍以（/1P%I 上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20C保存一個(gè)月）； 9 .用PBS將總蛋白稀釋到約1pg/以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白I/t,/ 在

8、細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10wg/61; 10 .加入一定體積的兔抗到500總蛋白中， 抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異； 11 .4C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2h 室溫孵育； 7j 12 .加入100林lProtein蹶脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4c緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h,如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2HlM渡抗體（兔抗鼠IgG,兔抗雞IgG）; 13 .14000rpm瞬時(shí)離心5s,收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPAbuffer洗3遍，800區(qū)遍，RIPAbuffer有時(shí)候會(huì)破

9、壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物 內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS; 14 .用60wl2上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量 依據(jù)上樣多少白需要而定（60口足夠上三道）；15 .將上樣樣品煮5min,以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊 脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20C,留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。 實(shí)驗(yàn)流程為： 1 .轉(zhuǎn)染后24-48h可收獲細(xì)胞， 加入適量細(xì)胞裂解緩沖液 （含蛋白酶抑制劑） ， 冰上裂解30min,細(xì)胞裂解液于4Q最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清； 2 .取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液加1區(qū)g相應(yīng)的抗體加入

10、到細(xì)胞裂 解液，4。C緩慢搖晃孵育過(guò)夜； （/1PX，.I 3 .取10PIprotein礴脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min; 4 .將預(yù)處理過(guò)的10wlproteinA脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4 C .一JJ- 1Z-_I./ 緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連； 5.免疫沉淀反應(yīng)后，在4 C以3,000rpm速度離心3min,將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗34次；最后加入15口的2XSDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘； 6.SDS-PAGE,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析。通

11、過(guò)免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白 1）用磷酸鹽緩沖液洗30塊10cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。 2）將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4c以最大速度離心 1 15min。 3）收集上清（約30ml）并加入30Hg的適當(dāng)抗體，4c搖動(dòng)免疫沉淀物1h。 4）加入0.9ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose懸液，4c搖動(dòng)免疫沉淀物30min。 5）用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物， 再重復(fù)洗5次。 最后， 用NETN洗一次。 6）吸出混合物的液體部分。加入800w的1XSDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4min

12、 7）將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10mA的恒定電流下電泳過(guò)夜。 8）通過(guò)考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。 9）從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1ml50%乙睛洗兩次，每次3min。10）用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。 11）通過(guò)窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自 動(dòng)Edman降解測(cè)序。 注意事項(xiàng) 1 .細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100）。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2%SDS）,細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。 2 .使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用 3 .使用對(duì)照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗