玉郎傘多糖對肝星狀細(xì)胞氧應(yīng)激脂質(zhì)過氧化作用的影響(一)

1、玉郎傘多糖對肝星狀細(xì)胞氧應(yīng)激脂質(zhì)過氧化作用的影響(一)    作者：黃必義，黃仁彬，盧曦，段小群【摘要】 目的 研究玉郎傘多糖(YLS)對肝星狀細(xì)胞（HSC）氧應(yīng)激脂質(zhì)過氧化作用的影響及機(jī)制。方法用H2O2誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA，SOD水平，MTT法測定肝星狀細(xì)胞的增殖，LDH法檢測YLS對肝星狀細(xì)胞的毒性作用，ELISA法測定I型膠原含量。結(jié)果YLS （25200g/ml）可明顯降低培養(yǎng)上清液中MDA含量和I型膠原水平，抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，提高SOD活力，并呈劑量依賴性。結(jié)論 YLS對肝星狀細(xì)胞的增殖及I型膠原的合成具有

2、抑制作用，該作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 玉郎傘多糖 肝星狀細(xì)胞 I型膠原Abstract：ObjectiveTo study the effects and its mechanism of Yulangsan polysaccharide(YLS) on the proliferation and collagen I production of hepatic stellate cell（HSC）induced by oxidative stress. MethodsThe lipid peroxidation of HSC was induced by H2O2.The l

3、evels of malondialdehyde(MDA) and SOD in cultural supernatant were determined by general methods.Cytotoxicity was measured by LDH method.The proliferation of hepatic stellate cells was measured by MTT method. The content of collagen I was measured by ELISA method.ResultsYLS （25200g/ml）concentration-

4、dependently decreased the levels of MDA and collagen I and the number of proliferating HSC ，and increased the activity of SOD . ConclusionYLS can inhibit the proliferation and collagen I production of hepatic stellate cell induced by oxidative stress. This might be associated with the anti-oxidative

5、 activity of YLS.Key words：Yulangsan polysaccharide； Hepatic stellate cells； Collagen I玉郎傘是一種尚未開發(fā)利用的民間草藥，為蝶型花科植物疏葉巖豆 Millettia pulchra Kurz var.laxior(Dunn)Z Wei 的塊根，具有散淤、消腫止痛之功能，民間用于高血壓病、肝炎、消化不良等疾病的治療。本課題組多年研究證實(shí)玉郎傘提取物具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，并對急、慢性實(shí)驗(yàn)性肝損傷均有明顯的保護(hù)作用1，2。玉郎傘多糖（Yulangsan Polysaccharide，YLS）是玉郎傘提取物中主

6、要的有效成分，為進(jìn)一步研究YLS對肝纖維化的作用，本研究用H2O2誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)過氧化3，觀察YLS對體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和I型膠原分泌的影響及機(jī)制，以探討YLS抗肝纖維化的機(jī)制。1 材料與儀器1.1 細(xì)胞來源肝星狀細(xì)胞系為HSC-T6，為SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSC。1.2 藥物及試劑YLS，由本室自行提取（分離得到的YLS多糖經(jīng)Sephadex-75凝膠柱層析，硫酸-苯酚法以及高效凝膠滲透色譜法證實(shí)為單一多糖，紫外掃描顯示無核酸和蛋白特征吸收峰，薄層色譜和氣相色譜表明由葡萄糖和阿拉伯糖組成，紅外光譜顯示有典型的多糖吸收峰。）；RPMI-1640(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季

7、青公司)；H2O2(重慶川江化學(xué)試劑廠)；丙二醛(MDA)，SOD，LDH試劑盒（南京建成生物工程研究所）；噻唑藍(lán)（MTT，Amerisco，北京拜爾迪生物公司分裝）；I型膠原試劑盒（美國BPB公司）。1.3 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma，Model 311）；TDL80-2B臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XD-101倒置顯微鏡（南京江南光電集團(tuán)股份有限公司）；相差倒置顯微鏡（德國Zeiss）；SZX型超凈工作臺（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠）；722s型可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）； 450型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad）。2 方法2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組將冷凍

8、保存于液氮中的HSC復(fù)蘇后接種于含10%小牛血清、100 IU/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素，4 mmol/L谷氨酰胺的RMPI1640培養(yǎng)液中，37，5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞呈單層致密狀時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化后傳代，24 h換液，72 h再次傳代。每次實(shí)驗(yàn)均在呈指數(shù)生長的細(xì)胞中進(jìn)行。分組：空白組；H2O2組； H2O2+ YLS 25 g/ml組；H2O2+ YLS 50 g/ml組； H2O2+YLS 100 g/ml組； H2O2+ YLS 200 g/ml組； H2O2+VitE 50 mol/L組。每組6孔，H2O2濃度均為3.0 mol/L，VitE為陽性對照4，各組

9、H2O2均于YLS干預(yù)前30 min加入。加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集細(xì)胞觀察各項(xiàng)指標(biāo)。2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖將HSC以1×105/ml培養(yǎng)于96孔板，培養(yǎng)48 h，換含藥的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組6孔，各孔加入20 l MTT試劑，輕輕混勻，繼續(xù)37培養(yǎng)4 h，吸出全部液體，加200 l DMSO，微量振蕩器上振蕩15 min，待溶解完全，于酶標(biāo)儀570 nm波長比色。2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)5LDH比色法檢測YLS對HSC-T6的細(xì)胞毒性。傳一代培養(yǎng)的HSC以5%小牛血清的1640培養(yǎng)液制備為1×105/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 l，至細(xì)胞

10、長至近單層后，分組后更換含5%小牛血清終濃度不同的YLS的1640培養(yǎng)液，每組6孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清，按乳酸脫氫酶(LDH)測試盒說明測定培養(yǎng)上清中的LDH活力。2.4 ELISA法測定上清液I型膠原含量6 將HSC以1×105/ml培養(yǎng)于96孔板，培養(yǎng)48 h換含藥的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清液。取出酶標(biāo)板，分別加入培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品，每組6孔；每孔加入50 l的酶標(biāo)記溶液；25孵育反應(yīng)90 min；洗液清洗6次；每孔加入底物A、B液各50 l；25孵育反應(yīng)15 min；每孔加入50 l終止液，終止反應(yīng)；于酶標(biāo)儀450 nm波長比色。2.5 MDA含量和SO

11、D活力測定按試劑盒說明測定。2.6 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。3 結(jié)果3.1 YLS對HSC-T6增殖的作用表1顯示，與空白對照組比較，模型組HSC的增殖明顯升高；與模型對照組比較，YLS各劑量組不同程度降低HSC的增殖，呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。表1 YLS對HSC增殖的影響（略）3.2 YLS的細(xì)胞毒性作用從表2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比， YLS各劑量組培養(yǎng)上清液中LDH活力未見顯著性差異，表明YLS無細(xì)胞毒性。表2 YLS對LDH活力的影響（略）3.3 YLS對HSC I型膠原水平的影響表3結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組型膠原水平明顯升高，給予YLS后

12、各劑量組型膠原水平明顯降低。表3 YLS對型膠原含量的影響（略）3.4 YLS對培養(yǎng)液中MDA和SOD活力的影響表4顯示，與空白對照組比較，模型組MDA水平明顯升高，而SOD活力顯著降低。給予YLS后，MDA水平明顯降低，SOD活力明顯升高，且呈明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。表4 YLS對MDA和SOD活力的影響(略)4 討論肝纖維化是一切慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段。近年來，對于肝纖維化發(fā)生機(jī)理的研究已深入到細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)水平。大量資料表明，HSC的增殖和活化是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，是各種病因致肝纖維化發(fā)生的共同中心環(huán)節(jié)7，8。HSC位于肝臟Disse間隙，正常情況下處于

13、“靜止?fàn)顟B(tài)”。當(dāng)肝臟損傷發(fā)生炎癥后，HSC被激活，并大量增殖。活化的HSC向肌纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)、分泌趨化因子及細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶合成異常等，最終導(dǎo)致肝纖維化9，10。氧化應(yīng)激在HSC活化、增殖中起重要作用1114。損傷的肝細(xì)胞、活化的Kupffer細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞均產(chǎn)生H2O2等活性氧（ROS），這些ROS及其脂質(zhì)過氧化物（LPO）降解產(chǎn)物，可以通過旁分泌機(jī)制刺激HSC活化；另外，外源性ROS也可直接刺激HSC增殖。有研究表明，致纖維形成細(xì)胞因子TGF-首先誘導(dǎo)HSC產(chǎn)生H2O2，增加的H2O2直接上調(diào)型膠原1mRNA表達(dá)；另外，以H2O2直接刺激HS

14、C后，型膠原1mRNA表達(dá)也明顯增加，加入過氧化氫酶則能逆轉(zhuǎn)TGF-引起的型膠原1RNA上調(diào)，因此減輕氧化應(yīng)激，阻止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生可以抑制HSC活化、增殖，減少膠原的合成，減輕肝纖維化。既往研究表明，YLS具有抗氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化的作用。因此本實(shí)驗(yàn)選用YLS研究它對氧應(yīng)激所致HSC纖維化效應(yīng)的影響。研究結(jié)果顯示，模型組HSC增殖明顯高于空白對照組，其機(jī)制可能是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物直接促進(jìn)HSC的激活和影響HSC的功能；YLS能明顯抑制HSC的增殖，各劑量組還明顯降低HSC培養(yǎng)液中型膠原的水平；YLS能明顯降低HSC培養(yǎng)液中異常升高M(jìn)DA的含量，同時(shí)提高SOD的活力。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它

15、的水平間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，而SOD的活力又間接反映機(jī)體清除自由基的能力，它們是一對互相影響的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其機(jī)制可能是氧應(yīng)激時(shí)SOD的活力下降，體內(nèi)的自由基失平衡，引起MDA大量產(chǎn)生，治療組可升高SOD的活力，降低了體內(nèi)的自由基水平，從而降低了MDA的水平。研究結(jié)果提示，YLS可能通過抑制脂質(zhì)過氧化從而抑制HSC的活化、增殖和ECM的生成，起到抗肝纖維化的作用。【參考文獻(xiàn)】1焦楊，段小群，黃仁彬，等.玉郎傘提取物對超氧陰離子自由基和羥自由基的抑制和清除作用J.廣西醫(yī)科大學(xué)報(bào),2004,21(1)：22.2黃仁彬，段小群，焦 楊，等.玉郎傘提取物對

16、小鼠急性化學(xué)性肝損傷保護(hù)作用及其機(jī)制的研究J.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,20(6):874.3劉 麗，姜慧卿，張曉嵐，等. 丹參單體IH7643對H2O2刺激肝星狀細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及其機(jī)制J.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2003，19(1)：78.4Parola RJ，Leonarduzzi G，Biasi F，et al.Vitamin E dietary supplementation protects against carbon tetrachloride-induced chronic liver damage and cirrhosisJ. Hepatology ，1992，16

17、(4)：1014.5劉永剛，劉永忠，王曉東，等. 姜黃素抗大鼠肝星狀細(xì)胞氧應(yīng)激脂質(zhì)過氧化作用的研究J. 中成藥，2004，26（10）：829.6Svegliati-Baroni G，Di Sario A，Casini A，et al.The Na+/H+ exchanger modulates the fibrogenic effect of oxidative stress in rat hepatic satellate cellsJ.J hepatol ，1999，30(5):868.7Solis-Herruzo JA, De La Torre P, Minoz-Yague MT, e

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