蔡錫渠—宮頸癌篩查技術(shù)HPV+檢測(cè)

1、 3HPVHPV的型別的型別v 目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)200種型別的人乳頭瘤病毒（HPV）。v 依據(jù)與生殖道腫瘤相關(guān)性，將HPV分為：HPV分型檢測(cè)的意義分型檢測(cè)的意義（1）預(yù)測(cè)受檢者發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)度，確定最佳的治療時(shí)期）預(yù)測(cè)受檢者發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)度，確定最佳的治療時(shí)期Gary M. Clifford et al ; Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14(5):115764提示：不同的高危型促進(jìn)LSIL（低度鱗狀上皮內(nèi)病變）向SCC（鱗狀細(xì)胞癌）轉(zhuǎn)變的能力有差異。 HPV16，18 的致宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)性大于其他高危型HPV。 基線篩查細(xì)胞學(xué)陰性基線篩查細(xì)胞學(xué)陰性/ /高危

2、高危HPVHPV陽(yáng)性的女性陽(yáng)性的女性1010年內(nèi)年內(nèi)CIN3CIN3病變的累積發(fā)病率病變的累積發(fā)病率vKhan MJ, et al. J Natl Cancer Inst 2005; 97:10721079.Follow-up time (months)Other high-risk HPV+HPV18+High-risk HPVHPV16+Cumulative incidence rate of CIN3 (%)17.2% (11.522.9) HPV16+13.6% (3.623.7) HPV18+3.0% (1.94.2) 其它高危型HPV陽(yáng)性0.8% (0.61.1) 高危型HPV陰性

3、4.5 1527395163758799119.5111020151050基線時(shí)HPV16/18陽(yáng)性者相比其它12種高危HPV型別陽(yáng)性者，有更高風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展為高度宮頸病變HPV16/18HPV16/18陽(yáng)性的短陽(yáng)性的短期風(fēng)險(xiǎn)也明顯高于其期風(fēng)險(xiǎn)也明顯高于其它致癌型它致癌型HPVHPV陽(yáng)性陽(yáng)性v對(duì)對(duì)204204例宮頸癌患者前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，例宮頸癌患者前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，HPV18HPV18型感染者是預(yù)后不良的重要指標(biāo)，型感染者是預(yù)后不良的重要指標(biāo)，HPV18HPV18陽(yáng)性陽(yáng)性5 5年存年存活率活率54.1%54.1%，而其他高危型感染的存活率為，而其他高危型感染的存活率為83.8%83.8%。HPV18H

4、PV18型陽(yáng)性者復(fù)發(fā)率型陽(yáng)性者復(fù)發(fā)率53.6%53.6%，而，而HPV16HPV16型復(fù)發(fā)型復(fù)發(fā)率僅為率僅為15.9%15.9%v5151例宮頸癌手術(shù)患者中，例宮頸癌手術(shù)患者中，9 9例發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移中有例發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移中有6 6例為例為HPV18HPV18型型v107107例晚期宮頸癌患者放療治療組中，例晚期宮頸癌患者放療治療組中，HPV18HPV18型陽(yáng)性者型陽(yáng)性者5 5年存活率為年存活率為15.5%15.5%，而，而HPV16HPV16型為型為73.1%73.1%對(duì)于群體而言對(duì)于群體而言HPV16HPV16型感染危害最大型感染危害最大對(duì)于個(gè)體而言對(duì)于個(gè)體而言HPV18HPV18型感染危險(xiǎn)度最

5、高型感染危險(xiǎn)度最高 （2）16、18亞型持續(xù)感染的危險(xiǎn)性大于其他亞型亞型持續(xù)感染的危險(xiǎn)性大于其他亞型v 對(duì)巴西1611名婦女在4個(gè)月間隔2次檢測(cè)HPV，HPV16，18持續(xù)陽(yáng)性致HSIL風(fēng)險(xiǎn)性大于其他高危型HPV持續(xù)陽(yáng)性。（Nicolas F. Schlecht, et.al. JAMA. 2001; 286(24): 3106-3114. ）宮頸癌的必要條件高危型的HPV感染HPV持續(xù)感染（3）針對(duì)不同型別的感染采取不同的處理方案）針對(duì)不同型別的感染采取不同的處理方案v 相同細(xì)胞及組織學(xué)類型相同細(xì)胞及組織學(xué)類型HPV陽(yáng)性與陰性要區(qū)別對(duì)待陽(yáng)性與陰性要區(qū)別對(duì)待v 不同不同HPV感染型別要區(qū)別對(duì)待

6、感染型別要區(qū)別對(duì)待 例如：建議HPV16,18型的患者直接進(jìn)行陰道鏡檢查；而對(duì)于其他型別的感染，要結(jié)合細(xì)胞學(xué)診斷，一般不需要采取任何治療方法，但需要按時(shí)隨訪。 44 44歲女性，歲女性，20082008年年1010月月2424日，婦檢宮頸光滑，滴蟲(chóng)（日，婦檢宮頸光滑，滴蟲(chóng)（+ +）HPV16HPV16，5252（+ +），TCTTCT：炎細(xì)胞中度。：炎細(xì)胞中度。未行陰道鏡檢查未行陰道鏡檢查，20102010年年1010月月1818日。陰道鏡下宮頸活檢日。陰道鏡下宮頸活檢病理病理: :鱗狀細(xì)胞癌（中分化）。未按規(guī)范篩查及隨訪，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生。鱗狀細(xì)胞癌（中分化）。未按規(guī)范篩查及隨訪，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)

7、生。 廣東省婦幼保健院廣東省婦幼保健院案例分析 熒光熒光PCR原理原理 在PCR反應(yīng)體系中有上下游引物，在熒光PCR體系中也有上下游引物，還加入了一個(gè)熒光基團(tuán)-探針 在PCR擴(kuò)增過(guò)程中,特異性引物和探針?lè)謩e與靶序列結(jié)合，由于此時(shí)熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)離的很近，猝滅基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的發(fā)光起到了抑制作用，因此熒光基團(tuán)不發(fā)光。 Taq酶在引物的引導(dǎo)下復(fù)制靶序列；當(dāng)遇到結(jié)合在兩條引物之間的探針時(shí)，發(fā)揮5端外切酶功能，將探針?biāo)?，水解下?lái)的熒光基團(tuán)受激發(fā)發(fā)射熒光，每合成一條DNA鏈發(fā)射一次熒光信號(hào)。 當(dāng)靶序列呈指數(shù)增長(zhǎng)時(shí)，發(fā)射的熒光信號(hào)量相應(yīng)增長(zhǎng)，因此只要標(biāo)本中含相應(yīng)型別的HPV病毒就會(huì)有熒光信號(hào)的積累，從而

8、達(dá)到檢測(cè)HPV DNA的目的。熒光猝滅HPV系列產(chǎn)品系列產(chǎn)品v1313種高危型種高危型HPVHPV檢測(cè)試劑盒檢測(cè)試劑盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68） 不分型不分型v1414種高危型種高危型HPVHPV檢測(cè)試劑盒檢測(cè)試劑盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68） 對(duì)對(duì)HPV16、18分型分型產(chǎn)品特點(diǎn)產(chǎn)品特點(diǎn)至少需要四通道以上的熒光PCR檢測(cè)儀器，一次檢測(cè)出14種高危HPV型別：HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56

9、， HPV-58，HPV-59 , HPV-66和HPV-68，同時(shí)能對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行分型檢測(cè)。具有-globin基因內(nèi)對(duì)照，可以監(jiān)測(cè)所檢測(cè)樣本的可靠性。在全封閉體系中完成擴(kuò)增與檢測(cè)，有效控制污染操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化操作，完成整個(gè)過(guò)程只需要2-3個(gè)小時(shí)。檢測(cè)區(qū)域設(shè)計(jì)在HPV基因組E E區(qū)區(qū)，避免造成漏診。 70%-80%的宮頸癌都的宮頸癌都是由是由HPV16、18型感染型感染引發(fā)的引發(fā)的，可見(jiàn)在HPV熒光分型的產(chǎn)品中，對(duì)HPV16、18分型的重要性SFDASFDA與歐盟的CECE認(rèn)證 資質(zhì)資質(zhì)DNA提取提取 取取800ul800ul樣本離心得沉淀樣本離心得沉淀 加入細(xì)胞裂解液加入細(xì)胞裂

10、解液50ul50ul，煮沸，煮沸10min10min 12000 12000離心離心10min10min即可上機(jī)即可上機(jī)若肉眼未見(jiàn)沉淀，可增加取樣量，再次離心收集沉淀；若沉淀雜質(zhì)較多，可用細(xì)胞保存液洗滌1-2次；血液多樣本，用蒸餾水洗滌1-2次；粘液多樣本，取樣時(shí)盡量去除粘液。應(yīng)注意防止爆蓋：金屬浴可壓重物（冰盒、冰袋等）水浴應(yīng)采用螺旋管蓋的離心管確保離心管質(zhì)量合格優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快捷、方便。：簡(jiǎn)單、快捷、方便。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：HPV DNA純度較差，含有血紅素、蛋白、脂類等純度較差，含有血紅素、蛋白、脂類等PCR抑制劑。抑制劑。v 針對(duì)男性樣本或女性疣體樣本（棉拭子樣本）（棉拭子樣本），先用細(xì)胞保

11、存液/生理鹽水洗脫，收集沉淀，而后與上述操作一致PCR試劑配制試劑配制HPV12+2 PCR MIX（l） Taq 酶（酶（l） DNA 模板（模板（l）1人份量 17.5 0.5 2/人份10人份量 175 5 2/人份v 按樣本數(shù)加入所需溶液的對(duì)應(yīng)量，充分混勻再分裝按樣本數(shù)加入所需溶液的對(duì)應(yīng)量，充分混勻再分裝儀器檢測(cè)通道選擇儀器檢測(cè)通道選擇HPV12+2 報(bào)告熒光報(bào)告熒光 淬滅熒光淬滅熒光12種高危型FAM NoneHPV16HEX/JOENoneHPV18ROX/Red 610None-globin Cy5 None 我們一般把熒光我們一般把熒光PCR的前的前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信

12、號(hào)（個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline，基線期），基線期） ，即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值，即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋。擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋。檢查檢查調(diào)整調(diào)整基線基線 熒光閾值的缺省設(shè)置是熒光閾值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（儀器自動(dòng)設(shè)置，倍（儀器自動(dòng)設(shè)置，auto）。但我們通常采用手動(dòng)設(shè)置（）。但我們通常采用手動(dòng)設(shè)置（manual），手動(dòng)設(shè)置的原則是該閾值要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)），手動(dòng)設(shè)置的原則是該閾值要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡

13、量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，真正照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，真正的信號(hào)出現(xiàn)在熒光信號(hào)超過(guò)閾值后。的信號(hào)出現(xiàn)在熒光信號(hào)超過(guò)閾值后。檢查檢查調(diào)整調(diào)整閾值閾值結(jié)果分析1 定性結(jié)果判讀定性結(jié)果判讀1）陰性對(duì)照）陰性對(duì)照Ct值均應(yīng)顯示為值均應(yīng)顯示為Undet。 陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照Ct值值36。 符合以上兩個(gè)條件，此反應(yīng)是為有效。符合以上兩個(gè)條件，此反應(yīng)是為有效。2）樣品的）樣品的Ct值顯示為值顯示為Undet，判斷為陰性。，判斷為陰性。3）樣品的）樣品的Ct值值40，判斷為陽(yáng)性；，判斷為陽(yáng)性；4）若為）若為40Ct值值45的樣本建議重做，重做結(jié)果的樣本建議重做，重做結(jié)果Ct值值40

14、者為陽(yáng)性，否則為陰性。者為陽(yáng)性，否則為陰性。5）如果出現(xiàn)）如果出現(xiàn)Ct值值15的強(qiáng)陽(yáng)性樣本，可直接報(bào)告為陽(yáng)性的強(qiáng)陽(yáng)性樣本，可直接報(bào)告為陽(yáng)性或自動(dòng)分析，并將其從樣品表中剔除，再按上面步驟分析其或自動(dòng)分析，并將其從樣品表中剔除，再按上面步驟分析其他樣本，或建議進(jìn)行他樣本，或建議進(jìn)行1/100稀釋重做。稀釋重做。定性報(bào)告單上，定量結(jié)果欄及參考定性報(bào)告單上，定量結(jié)果欄及參考范圍設(shè)置為范圍設(shè)置為N/A（無(wú)效欄）（無(wú)效欄）結(jié)果分析1 擴(kuò)增曲線出現(xiàn)交叉擴(kuò)增曲線出現(xiàn)交叉擴(kuò)增曲線出現(xiàn)交叉，主要是因擴(kuò)增曲線出現(xiàn)交叉，主要是因?yàn)槎嘁?、多探針?lè)磻?yīng)體系中，每為多引物、多探針?lè)磻?yīng)體系中，每種型別的擴(kuò)增效率不一樣所致。同

15、種型別的擴(kuò)增效率不一樣所致。同時(shí)，樣本本身的原因也可能造成熒時(shí)，樣本本身的原因也可能造成熒光曲線的差異。光曲線的差異。常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案2 單個(gè)臨床樣本擴(kuò)增曲線底部上坡式單個(gè)臨床樣本擴(kuò)增曲線底部上坡式不斷抬高不斷抬高加入的樣本加入的樣本DNA含有很多雜質(zhì)。含有很多雜質(zhì)。重做重做，加樣前，樣本，加樣前，樣本DNA 13000rpm離心離心10分鐘，移液時(shí)取上清，移液器槍頭浸分鐘，移液時(shí)取上清，移液器槍頭浸入液面入液面2mm處。處。3 個(gè)別熒光曲線突然個(gè)別熒光曲線突然(較大較大)下降下降反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后可能會(huì)造成氣泡破裂，使熒光值突變后可能會(huì)造成氣泡破

16、裂，使熒光值突變降低降低，加入模板加入模板DNA后混勻離心，把后混勻離心，把反應(yīng)管放置儀器內(nèi)時(shí)要檢查管內(nèi)是否有反應(yīng)管放置儀器內(nèi)時(shí)要檢查管內(nèi)是否有氣泡。氣泡。4 陰性對(duì)照產(chǎn)生較高熒光陰性對(duì)照產(chǎn)生較高熒光反應(yīng)反應(yīng)MIX被污染；反應(yīng)管不干凈，被污染；反應(yīng)管不干凈，有雜物；反應(yīng)過(guò)程中探針降解。有雜物；反應(yīng)過(guò)程中探針降解。5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳加樣存在誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯加樣存在誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；度；標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解，應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解，應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案6 閾值設(shè)置不同，是否會(huì)導(dǎo)致

17、陰陽(yáng)性結(jié)果判斷的不統(tǒng)一？閾值設(shè)置不同，是否會(huì)導(dǎo)致陰陽(yáng)性結(jié)果判斷的不統(tǒng)一？結(jié)果的判讀不能只依賴于結(jié)果的判讀不能只依賴于Ct值的大小，還要看是否出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線。二者值的大小，還要看是否出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線。二者結(jié)合才能判斷試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)合才能判斷試驗(yàn)結(jié)果。閾值設(shè)置的高低會(huì)使閾值設(shè)置的高低會(huì)使Ct值有一定的變化，但變化一般都比較小。只有很少的樣值有一定的變化，但變化一般都比較小。只有很少的樣本會(huì)出現(xiàn)在本會(huì)出現(xiàn)在Ct=40左右波動(dòng)。這樣的樣本如擴(kuò)增曲線明顯可以判讀為陽(yáng)性，如擴(kuò)左右波動(dòng)。這樣的樣本如擴(kuò)增曲線明顯可以判讀為陽(yáng)性，如擴(kuò)增曲線不明顯或熒光增長(zhǎng)值不高則建議重做。增曲線不明顯或熒光增長(zhǎng)值不高則建議

18、重做。常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案7 檢測(cè)方法中檢測(cè)方法中“定性定性”和和“定量定量”的問(wèn)題的問(wèn)題目前，尚沒(méi)有任何一種檢測(cè)方法可以達(dá)到目前，尚沒(méi)有任何一種檢測(cè)方法可以達(dá)到“定量定量”檢測(cè)檢測(cè)HPV病毒的目的。這是由于病毒的目的。這是由于采樣方法本身的局限性所造成的：采樣方法本身的局限性所造成的：在采集宮頸脫落細(xì)胞的過(guò)程中，雖然反復(fù)強(qiáng)調(diào)要采集在采集宮頸脫落細(xì)胞的過(guò)程中，雖然反復(fù)強(qiáng)調(diào)要采集“HPV易感區(qū)易感區(qū)轉(zhuǎn)化帶轉(zhuǎn)化帶”的脫落細(xì)胞，但由于不同操作人員對(duì)的脫落細(xì)胞，但由于不同操作人員對(duì)“易感區(qū)易感區(qū)”部位的判斷以及取樣手法的不同，我部位的判斷以及取樣手法的不同，我們不能準(zhǔn)確評(píng)估出取得的細(xì)胞樣品中攜帶病毒分子的細(xì)胞數(shù)量。們不能準(zhǔn)確評(píng)估出取得的細(xì)胞樣品中攜帶病毒分子的細(xì)胞數(shù)量。比如：在第一次采集細(xì)胞樣品時(shí)，取得了比如：在第一次采集細(xì)胞樣品時(shí)，取得了500個(gè)攜帶病毒分子的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)檢測(cè)后個(gè)攜帶病毒分子的