血紅蛋白的提取與分離(2)ppt課件

1、 消費(fèi)和生活中運(yùn)用酶制劑和固定化酶，都需消費(fèi)和生活中運(yùn)用酶制劑和固定化酶，都需求把從微生物細(xì)胞中提取分別出來。求把從微生物細(xì)胞中提取分別出來。 細(xì)胞中有許多種蛋白質(zhì)，怎樣才干將所需求細(xì)胞中有許多種蛋白質(zhì)，怎樣才干將所需求的酶提取分別出來呢？的酶提取分別出來呢？20032003年年4 4月月1414日宣布人類基因組序列圖完成，這標(biāo)志著進(jìn)日宣布人類基因組序列圖完成，這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組時(shí)代。入了后基因組時(shí)代。人類基因組：指人類基因組：指DNADNA分子所攜帶的全部遺傳信息。分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對(duì)蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是

2、對(duì)蛋白質(zhì)功能的研討蛋白質(zhì)功能的研討課題 3 血紅蛋白的提取和分別課題背景課題背景 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可短少的物質(zhì)。隨著人類基因組蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可短少的物質(zhì)。隨著人類基因組方案的進(jìn)展以及多種生物基因組測(cè)序任務(wù)的完成，人類跨方案的進(jìn)展以及多種生物基因組測(cè)序任務(wù)的完成，人類跨入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代。對(duì)蛋白質(zhì)的研討與運(yùn)用，入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代。對(duì)蛋白質(zhì)的研討與運(yùn)用，首先需求獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此，從復(fù)雜的細(xì)胞混首先需求獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此，從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中提取、分別高純度的蛋白質(zhì)是生物科學(xué)研討中經(jīng)常合物中提取、分別高純度的蛋白質(zhì)是生物科學(xué)研討中經(jīng)常要做的任務(wù)。要做的任務(wù)。

3、血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分擔(dān)任血液中分擔(dān)任血液中O2和和CO2的運(yùn)偷。在本課題中，我們將以的運(yùn)偷。在本課題中，我們將以血紅蛋白為實(shí)驗(yàn)材抖，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)提取和分別的一些根本血紅蛋白為實(shí)驗(yàn)材抖，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)提取和分別的一些根本才技術(shù)才技術(shù) 占細(xì)胞干重的占細(xì)胞干重的5050以上，細(xì)胞中含量最多的有機(jī)物以上，細(xì)胞中含量最多的有機(jī)物關(guān)于血紅蛋白關(guān)于血紅蛋白1、元素組成、元素組成2、分子構(gòu)造、分子構(gòu)造3、顏色、顏色4、存在細(xì)胞、存在細(xì)胞5、生理功能、生理功能6 、獲得方法、獲得方法、 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差別，根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差別，如分子的外

4、形和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和如分子的外形和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來分別不吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來分別不同蛋白質(zhì)。同蛋白質(zhì)。問：根據(jù)什么來分別和提取蛋白質(zhì)原理問：根據(jù)什么來分別和提取蛋白質(zhì)原理P65T5P65T51313根底知識(shí)根底知識(shí)閱讀并回答閱讀并回答P64P64 1 1、凝膠色譜法另一個(gè)稱號(hào)；、凝膠色譜法另一個(gè)稱號(hào)； 2 2、凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)的根據(jù)；、凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)的根據(jù)； 3 3、凝膠的本質(zhì)；、凝膠的本質(zhì)； 4 4、凝膠色譜法、凝膠色譜法 5 5、凝膠色譜法的原理。、凝膠色譜法的原理。根底知

5、識(shí)一根底知識(shí)一 凝膠色譜法凝膠色譜法1 1、凝膠色譜法的別名：分配色譜法、凝膠色譜法的別名：分配色譜法 是根據(jù)相對(duì)分予質(zhì)量的大小分別蛋白質(zhì)的有效方是根據(jù)相對(duì)分予質(zhì)量的大小分別蛋白質(zhì)的有效方法。法。 4 4、凝膠、凝膠 性質(zhì)：一些微小的多孔球體，球內(nèi)含許多貫穿的通性質(zhì)：一些微小的多孔球體，球內(nèi)含許多貫穿的通道；道； 化學(xué)本質(zhì)：多糖類化合物：化學(xué)本質(zhì)：多糖類化合物： 實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖：實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖：2 2、凝膠色譜法的概念：、凝膠色譜法的概念： 根據(jù)被分別物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利根據(jù)被分別物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利器具有網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)展分別。器具有網(wǎng)

6、狀構(gòu)造的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)展分別。根底知識(shí)一根底知識(shí)一 凝膠色譜法凝膠色譜法3 3、根據(jù)的特性蛋白質(zhì)分子量的大小。、根據(jù)的特性蛋白質(zhì)分子量的大小。 原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)經(jīng)過凝膠時(shí)，相原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)經(jīng)過凝膠時(shí)，相對(duì)對(duì) 的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，挪動(dòng)速，挪動(dòng)速度度 ，而，而 的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在在 挪動(dòng)，路程挪動(dòng)，路程 ，挪動(dòng)速度挪動(dòng)速度 ，相對(duì)分子質(zhì)量不同，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分別。的蛋白質(zhì)因此得以分別。相對(duì)分子質(zhì)量較小相對(duì)分子質(zhì)量較小較長(zhǎng)較長(zhǎng)較慢較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大相對(duì)

7、分子質(zhì)量較大凝膠外部凝膠外部較短較短較快較快根底知識(shí)一根底知識(shí)一 凝膠色譜法凝膠色譜法根底知識(shí)一根底知識(shí)一 凝膠色譜法凝膠色譜法根底知識(shí)一根底知識(shí)一 凝膠色譜法凝膠色譜法1、我們?cè)谑裁吹胤接龅竭^緩沖物質(zhì)的？、我們?cè)谑裁吹胤接龅竭^緩沖物質(zhì)的？2、緩沖物質(zhì)有哪些？、緩沖物質(zhì)有哪些？3、緩沖溶液的作用是什么？、緩沖溶液的作用是什么？4、怎樣配制緩沖溶液？、怎樣配制緩沖溶液？根底知識(shí)二緩沖溶液根底知識(shí)二緩沖溶液1 1、緩沖溶液概念、緩沖溶液概念 在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液堿或稍加稀釋不引起溶液PHPH發(fā)生明顯變化的作用發(fā)生明顯變化

8、的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。液?？梢缘挚雇饨绲乃峄驂A的對(duì)溶液的可以抵抗外界的酸或堿的對(duì)溶液的PHPH值的影值的影響，維持響，維持PHPH根本不變。根本不變。根底知識(shí)二緩沖溶液根底知識(shí)二緩沖溶液3 3、緩沖溶液配制、緩沖溶液配制 通常由通常由1 12 2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)理緩沖劑的運(yùn)用比例就可以制得在不同理緩沖劑的運(yùn)用比例就可以制得在不同PHPH范圍內(nèi)范圍內(nèi)運(yùn)用的緩沖液。運(yùn)用的緩沖液。弱酸和弱酸鹽組合弱酸和弱酸鹽組合4 4、緩沖溶液的組分分類、緩沖溶液的組分分類根底知識(shí)二緩沖溶液根底知識(shí)二

9、緩沖溶液弱堿和弱堿鹽弱堿和弱堿鹽多元弱酸的酸式鹽和其他所對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽多元弱酸的酸式鹽和其他所對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽思索：思索： 他以為在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什他以為在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么？么？ 它的目的是什么？它的目的是什么？ 運(yùn)用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)運(yùn)用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的的PHPH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常構(gòu)造和功能，便于察看環(huán)境，保證血紅蛋白的正常構(gòu)造和功能，便于察看( (紅色紅色) )和科學(xué)研討和科學(xué)研討( (活性活性) )。根底知識(shí)二緩沖溶液根底知識(shí)二緩沖溶液 生物體內(nèi)進(jìn)展的各種生物化學(xué)反響都是在一定的生物體內(nèi)進(jìn)展的各種生物化

10、學(xué)反響都是在一定的pH下進(jìn)展的，為了可以在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的下進(jìn)展的，為了可以在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程，就必需堅(jiān)持體外的過程，就必需堅(jiān)持體外的pH與體內(nèi)的根本一致。因此，與體內(nèi)的根本一致。因此，緩沖溶液的正確配制和緩沖溶液的正確配制和pH的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研討任務(wù)中有著極其重要的意義。討任務(wù)中有著極其重要的意義。問：在生物化學(xué)的研討任務(wù)，為什么要正確配制緩沖溶液?jiǎn)枺涸谏锘瘜W(xué)的研討任務(wù)，為什么要正確配制緩沖溶液和準(zhǔn)確測(cè)定緩沖溶液的和準(zhǔn)確測(cè)定緩沖溶液的pH？閱讀第閱讀第65頁的相關(guān)內(nèi)容，回答以下問題：頁的相關(guān)內(nèi)容，回答以下問題： 1、電泳的

11、概念；、電泳的概念； 2、電泳的原理；、電泳的原理； 3、電泳的種類；、電泳的種類； 4、SDS的作用。的作用。根底知識(shí)三電泳根底知識(shí)三電泳1 1、概念、概念帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。2 2、原理、原理 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的離的基團(tuán)，在一定的PHPH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。根底知識(shí)三電泳根底知識(shí)三電泳 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極挪動(dòng)。相反的電極挪動(dòng)。

12、 電泳利用了待分別樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差別以電泳利用了待分別樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差別以及分子本身的大小，外形的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷及分子本身的大小，外形的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分別。移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分別。3 3、電泳的類型、電泳的類型瓊脂糖凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。根底知識(shí)三電泳根底知識(shí)三電泳 原理：許多重要的生物大分子，如原理：許多重要的生物大分子，如 等都具有等都具有( ) 在在( )下，這些基團(tuán)會(huì)帶上下，這些基團(tuán)會(huì)帶上 。在電場(chǎng)的作用下，這些。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其帶

13、電分子會(huì)向著與其 挪動(dòng)。電泳利用了待分別樣品中各種分子挪動(dòng)。電泳利用了待分別樣品中各種分子 以及分子本身以及分子本身 、 的不同使帶電分的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的子產(chǎn)生不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分別。樣品中各種分子的分別。多肽、核酸多肽、核酸可解離的基團(tuán)可解離的基團(tuán)正電或負(fù)電正電或負(fù)電所帶電荷相反的電極所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差別帶電性質(zhì)的差別大小大小外形的外形的遷移速度遷移速度一定的一定的PH根底知識(shí)三電泳根底知識(shí)三電泳 十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺

14、甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠。構(gòu)造的凝膠。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等要素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等要素。原理原理根底知識(shí)三電泳根底知識(shí)三電泳4 4、實(shí)例、實(shí)例 SDS SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDSSDS的作用下會(huì)解聚成單條肽的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。鏈，因此測(cè)定

15、的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDSSDS能與各種蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)能與各種蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)合物，復(fù)合物，SDSSDS所所帶負(fù)電荷的量大大超越了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。帶負(fù)電荷的量大大超越了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因此掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷因此掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。移率完全取決于分子的大小。 SDS SDS作用機(jī)理作用機(jī)理為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中參與為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中參與SDSSDS。根底知識(shí)三電泳根底知識(shí)三電泳為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中參與

16、中參與( )。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是( )。SDS能與各種蛋白質(zhì)能與各種蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的所帶負(fù)電荷的量大大超越了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因此量大大超越了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因此掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于遷移率完全取決于( )。 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率

17、取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等要素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等要素。SDS單條肽鏈的分子量單條肽鏈的分子量分子的大小分子的大小實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，思索以下問題：閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，思索以下問題： 1、蛋白質(zhì)的提取和分別普通分成幾步？、蛋白質(zhì)的提取和分別普通分成幾步？ 2、樣品怎樣處置？、樣品怎樣處置？ 3、蛋白質(zhì)怎樣分別？、蛋白質(zhì)怎樣分別？實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作一樣品處置一樣品處置樣品處置樣品處置粗分別粗分別純化純化純度鑒定純度鑒定問：蛋白質(zhì)提取和分別步驟？問：蛋白質(zhì)提取和分別步驟？實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置 血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中紅細(xì)胞最多。在紅

18、細(xì)胞的血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中紅細(xì)胞最多。在紅細(xì)胞的組成中，約組成中，約9090是血紅蛋白。血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成是血紅蛋白。血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成( (如圖如圖) )，包，包括兩個(gè)括兩個(gè)-肽鏈和兩個(gè)肽鏈和兩個(gè)-肽鏈。其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素肽鏈。其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分了二氧化碳。血紅蛋白因含有基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分了二氧化碳。血紅蛋白因含有血紅素而呈現(xiàn)紅色。血紅素而呈現(xiàn)紅色。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置 每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白

19、因可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色含有血紅素而呈紅色血紅蛋白組成及作用血紅蛋白組成及作用選材選材 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來分別血紅蛋白。血液來分別血紅蛋白。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置1 1、紅細(xì)胞的洗滌、紅細(xì)胞的洗滌 閱讀課本內(nèi)容，回答以下問題：閱讀課本內(nèi)容，回答以下問題： 1、洗滌的目的？、洗滌的目的？ 2、怎樣洗滌？、怎樣洗滌？ 3、洗滌干凈的標(biāo)志是什么？、洗滌干凈的標(biāo)志是什么？1 1 除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分別純化。除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分別純化。 2 2 采

20、樣分別吸漿倒紅加液攪拌重洗三次采樣分別吸漿倒紅加液攪拌重洗三次3 直至上清液中沒有黃色，闡明紅細(xì)胞已洗滌干凈。直至上清液中沒有黃色，闡明紅細(xì)胞已洗滌干凈。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置1 1、速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉、速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分別的效果。淀達(dá)不到分別的效果。問：?jiǎn)枺? 1、洗滌操作過程中，為什么要低速短時(shí)間離心？、洗滌操作過程中，為什么要低速短時(shí)間離心？2 2、為了使紅細(xì)胞洗滌干凈，需如何處置？、為了使紅細(xì)胞洗滌干凈，需如何處置？3 3、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.90.9的氯化鈉溶液洗滌，的氯化鈉溶液洗滌，能否用蒸

21、餾水或濃度高的氯化鈉溶液？為什么？能否用蒸餾水或濃度高的氯化鈉溶液？為什么？1 1、紅細(xì)胞的洗滌、紅細(xì)胞的洗滌2 2、反復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，闡明紅細(xì)胞、反復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，闡明紅細(xì)胞已洗滌干凈。已洗滌干凈。 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置 紅細(xì)胞的洗滌紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分別純化。采集的血樣蛋白，以利于后續(xù)步驟的分別純化。采集的血樣要及時(shí)分別紅細(xì)胞，分別時(shí)采用低速短時(shí)間離心，要及時(shí)分別紅細(xì)胞，分別時(shí)采用低速短時(shí)間離心，如如500 rrain離心離心2min，然后用膠頭吸管吸出上，然后用膠頭吸管

22、吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再參與五倍體積的生理鹽水倒入燒杯，再參與五倍體積的生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為為0.9的的NaCl溶液溶液)，緩慢攪拌，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)，低速短時(shí)間離心，如此反復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有間離心，如此反復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，闡明紅細(xì)胞已洗滌干凈。黃色，闡明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 1.1.紅細(xì)胞的洗滌紅細(xì)胞的洗滌實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置2.2.血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放 血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，加蒸餾

23、水到原血液的體積，再加加蒸餾水到原血液的體積，再加40體積的甲苯，置于體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢璐帕嚢杵魃铣浞謹(jǐn)嚢?0 min。在蒸餾水和甲苯的作用。在蒸餾水和甲苯的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。 說出：蒸餾水和甲苯的作用。說出：蒸餾水和甲苯的作用。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置3.3.分別血紅蛋白溶液分別血紅蛋白溶液 分別血紅蛋白溶液分別血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以管中，以2000 rmin的速度離心的速度離心10min后，可以明顯看后，可以明顯看到試管中的溶液分為到試管中的溶液分為4層。

24、從上往下數(shù)，第層。從上往下數(shù)，第1層為無色透層為無色透明的甲苯層，第明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。分出下層的紅色透明液體。問：?jiǎn)枺? 1、采用什么方法分別血紅蛋白？、采用什么方法分別血紅蛋白？2 2、離心分層后，各層的成分各是

25、什么？、離心分層后，各層的成分各是什么？3 3、用濾紙過濾，去掉什么成分？、用濾紙過濾，去掉什么成分？實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置 取取1mL1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有入盛有300mL300mL的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L20mmol/L的磷酸緩沖的磷酸緩沖液中液中pHpH為為7.07.0，透析，透析12h12h。4.4.透析透析問：透析過程及透析目的？問：透析過程及透析目的？透析目的是：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。透析目的是：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。闡明：透析袋是一種半透膜，能使小分子自在進(jìn)出，而

26、大闡明：透析袋是一種半透膜，能使小分子自在進(jìn)出，而大分分 子不能經(jīng)過。子不能經(jīng)過。思索：根據(jù)資料進(jìn)展實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：現(xiàn)有燒杯一只、透析袋一思索：根據(jù)資料進(jìn)展實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：現(xiàn)有燒杯一只、透析袋一個(gè)、碘液、淀粉溶液、鐵架臺(tái)一個(gè)、棉線假設(shè)干。探求碘個(gè)、碘液、淀粉溶液、鐵架臺(tái)一個(gè)、棉線假設(shè)干。探求碘液、淀粉能否能經(jīng)過透析袋。寫出實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果預(yù)測(cè)。液、淀粉能否能經(jīng)過透析袋。寫出實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置4.4.透析透析實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 一樣品處置一樣品處置 閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，了解凝膠色譜的操作過程。閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，了解凝膠色譜的操作過程。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 二凝膠色譜操作二凝膠色

27、譜操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 二凝膠色譜操作二凝膠色譜操作本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否那么難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，凹穴底面，否那么難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分別不徹底。蛋白質(zhì)分別不徹底。2凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填 裝柱前要將色譜柱垂直固定在支裝柱前要將色譜柱垂直固定在支架上。由于干的凝膠和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別架上。由于干的凝膠和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大，因此裝柱前需求根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需求的很大，因此裝柱前需求根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需求的凝膠量。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的

28、是交聯(lián)葡聚糖凝膠。凝膠量。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的是交聯(lián)葡聚糖凝膠。“G表示凝表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分別范圍，膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分別范圍，75表示凝膠得水表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.59。凝膠用蒸餾水充分溶脹。凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，在與色譜柱下端銜接的尼龍管翻開后，配成凝膠懸浮液，在與色譜柱下端銜接的尼龍管翻開的情況下，的情況下， 一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)可悄然敲一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)可悄然敲動(dòng)色譜柱，使凝膠裝填均勻。留意色譜柱內(nèi)不能有氣泡存動(dòng)色譜柱，使凝膠裝填均勻。留意色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡，必需重裝。裝填

29、完后，立刻銜接緩在，一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡，必需重裝。裝填完后，立刻銜接緩沖液洗脫瓶，在約沖液洗脫瓶，在約50 cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用300 mL的物的物質(zhì)的量濃度為質(zhì)的量濃度為20 mmolL的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液(pH為為7.0)充分洗充分洗滌平衡凝膠滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填嚴(yán)密。，使凝膠裝填嚴(yán)密。 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 二凝膠色譜操作二凝膠色譜操作2.2.凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填問問:1:1、凝膠的選擇資料、凝膠的選擇資料? G? G代表意義代表意義? ? 2 2、簡(jiǎn)單步驟、簡(jiǎn)單步驟? ? 3 3、留意點(diǎn)：、留意點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 二凝膠色譜操作二凝膠色譜操作選擇交聯(lián)

30、葡聚糖凝膠選擇交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75G-75 “G G表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分別范圍表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分別范圍, 75, 75表表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.57.5克?？?。固定色譜柱配凝膠懸液裝填色譜柱洗滌平衡固定色譜柱配凝膠懸液裝填色譜柱洗滌平衡3.3.凝膠裝填時(shí)盡量嚴(yán)密，以降凝膠裝填時(shí)盡量嚴(yán)密，以降低凝膠顆粒之間的空隙；低凝膠顆粒之間的空隙； 裝裝填凝膠柱時(shí)不得氣泡存在。填凝膠柱時(shí)不得氣泡存在。由于氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋由于氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分別效白質(zhì)的洗脫次序，降低分別效果。果。2.2.凝膠色譜柱的

31、裝填凝膠色譜柱的裝填實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 二凝膠色譜操作二凝膠色譜操作問問:1:1、凝膠的選擇資料、凝膠的選擇資料? G? G代表意義代表意義? ? 2 2、簡(jiǎn)單步驟、簡(jiǎn)單步驟? ? 3 3、留意點(diǎn)：、留意點(diǎn)： 裝填終了后，立刻用緩沖液洗脫瓶，在裝填終了后，立刻用緩沖液洗脫瓶，在50cm50cm高的操作高的操作壓下，用壓下，用300mL300mL的的20mmol/L20mmol/L的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液pHpH為為7.07.0充分充分洗滌平衡洗滌平衡12h12h。問：洗滌平衡的溶液？留意什么？問：洗滌平衡的溶液？留意什么？1 1、液面不要低于凝膠外表，否那么能夠有氣泡混入，影、液面不要低于凝膠外

32、表，否那么能夠有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分別效果；響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分別效果；2 2、不能發(fā)生洗脫液流干，顯露凝膠顆粒的景象。、不能發(fā)生洗脫液流干，顯露凝膠顆粒的景象。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 二凝膠色譜操作二凝膠色譜操作2.2.凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填3.樣品的參與和洗脫樣品的參與和洗脫 加樣前，翻開色譜柱下端加樣前，翻開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，封鎖出口。用吸管小心地將與凝膠面平齊，封鎖出口。用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端透析后的樣品加到色譜

33、柱的頂端(圖圖5-22)，留意不，留意不要破壞凝膠面。加樣后，翻開下端出口，使樣品要破壞凝膠面。加樣后，翻開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，封鎖滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，封鎖下端出口。小心參與物質(zhì)的量濃度為下端出口。小心參與物質(zhì)的量濃度為20 mmolL的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液(pH為為7.0)到適當(dāng)高度，銜接緩沖液到適當(dāng)高度，銜接緩沖液洗脫瓶，翻開下端出口，進(jìn)展洗脫。待紅色的蛋洗脫瓶，翻開下端出口，進(jìn)展洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管搜集流出液，每白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管搜集流出液，每5 mL搜集一管，延續(xù)搜集搜集一管，延續(xù)搜集(圖圖521)

34、。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 二凝膠色譜操作二凝膠色譜操作3.3.樣品參與與洗脫樣品參與與洗脫調(diào)理緩沖液面調(diào)理緩沖液面滴加透析樣品滴加透析樣品 吸管吸吸管吸1mL1mL樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞挪動(dòng)加樣，同時(shí)留意不要破壞凝膠面。管管口貼著管壁環(huán)繞挪動(dòng)加樣，同時(shí)留意不要破壞凝膠面。 加樣前，翻開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面加樣前，翻開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，封鎖出口。上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，封鎖出口。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 二凝膠色譜操作二凝膠色譜操作樣品滲入凝膠床樣品滲入凝膠床 加樣后，翻開下端出口，使樣品滲入凝膠