高效液相色譜法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白

1、0引言膠原水解蛋白大多是利用制革工業(yè)副產品皮革渣、皮革屑、皮角廢料等為原料,經過酸堿水解并脫鉻處理后生產的新型高蛋白產品。它是一種廉價蛋白原料,在乳中摻加膠原水解蛋白能夠提高乳中蛋白含量,降低成本。但是摻加膠原水解蛋白不僅影響乳的口感和風味、改變牛乳的溶解度,而且膠原水解蛋白比乳蛋白的營養(yǎng)價值低,會嚴重影響消費者的健康狀況。因此,為了加強對牛乳的衛(wèi)生監(jiān)督和管理,必須建立一種快速并且靈敏度較高的檢測方法來判斷牛乳中有無摻加膠原水解蛋白,并對其進行定性和定量分析。羥脯氨酸(hydroxyproline ,Hyp是膠原蛋白所特有的氨基酸,在正常膠原蛋白中含量約13.4%,在其他蛋白中很少發(fā)現1,根據

2、測得的羥脯氨酸含量再乘以相應的系數就可以得到膠原蛋白的質量分數2。膠原水解蛋白是由膠原蛋白水解得到的,因此Hyp 也是膠原水解蛋白所特有的氨基酸。羥脯氨酸的測定方法包括比色法3、氨基酸分析儀法和HPLC 法4-6、電泳法等。高效液相色譜(HPLC 法因其具有分離度高、選擇性好等優(yōu)點,自20世紀70年代以來,開始應用于氨基酸的分析測定中。隨著研究的不斷深入,柱前衍生與HPLC 法相結合已成為氨基酸分離和分析的有力工具,本研究的目的就是將柱前衍生與HPLC 法結合起收稿日期:2008-01-15作者簡介:李景紅(1982-,女,碩士,研究方向為乳品科學與技術。通訊作者:孟祥晨高效液相色譜法檢測牛乳

3、中摻加的膠原水解蛋白李景紅,孟祥晨(東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室/食品學院,哈爾濱150030摘要:本研究的目的是建立采用高效液相色譜測定牛乳中摻加膠原水解蛋白的方法。其基本原理是通過高效液相色譜法測得羥脯氨酸的含量,由測得的羥脯氨酸含量換算得出乳中摻加的膠原水解蛋白的量。以symmetry-C18(150mm 3.9mm,i.d.5m為色譜柱,2,4-二硝基氟苯為衍生試劑,梯度洗脫。流動相A :濃度為0.05mol/L 乙酸鈉緩沖溶液(pH=6.5,含10mL/L 四氫呋喃,流動相B :乙腈-水(體積比11。羥脯氨酸質量濃度在210mg/L 的范圍內與峰面積之間具有良好的線性關系,回

4、收率為93.47%101.20%,檢出限為2.5mg/L 。測定結果的相對標準偏差為1.62%。關鍵詞:高效液相色譜法;柱前衍生;膠原水解蛋白;2,4-二硝基氟苯;羥脯氨酸中圖分類號:TS252.7文獻標識碼:A文章編號:1001-2230(200811-0056-04Detection of hydrolyzed animal collagen proteins in milk by HPLCLI Jing-hong,MENG Xiang-chen(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Food Science &Tech

5、nology College,Northeast AgriculturalUniversity,Harbin 150030,China Abstract:The aim of this study is to establish a method to determine hydrolyzed collagen proteins adulterated in milk by HPLC.The content of hydroxyproline (Hypcan be determined by HPLC,and the content of hydrolyzed collagen protein

6、s in adulterated milk was then calculated by Hyp content.Chromatographic conditions include that a symmetry-C18(150mm 3.9mm,i.d.5mwas used,the mobile phase A was 0.05mol/L sodium acetate buffer (pH=6.5containing 10mL/L tetrahydrofuranand the mobile phase B was acetonitrile-water(volume ratio being 1

7、1,the separation was performed with gradient elution,and 2,4-dinitro fluoroenzene (DNFB-acetonitrile was used as the pre-col -umn derivatization of the Hyp.There was a good linear relationship between the peak area and the concentration of the Hyp in the range of 210mg/L.The detection limit is 2.5mg

8、/L,the recovery was 93.47%101.20%,and the RSD was 1.62%.Key words:HPLC ;pre-column derivatization ;hydrolyzed collagen proteins ;2,4-dinitro fluorobenzene ;Hydroxyproline rpgy中國乳品工業(yè)來測定牛乳中羥脯氨酸的質量分數。1實驗1.1材料羥脯氨酸(層析純,膠原水解蛋白粉,乙腈(色譜純,2,4-二硝基氟苯(DNFB,四氫呋喃(HPLC級,牛乳。1.2儀器高效液相色譜儀(Waters,symmetry-c18柱,Mil-li-Q

9、純水機,0.22m Millipore濾膜,KQ-800GKDV 型高功率恒溫數控超聲波清洗器,HP-01VACUUM/ PRESSURE PUMP,砂芯過濾裝置。1.3方法1.3.1色譜條件色譜柱:symmetry-C18(150mm3.9mm,i.d.5m;流動相A為濃度0.05mol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH=6.5,含10mL/L四氫呋喃;流動相B為乙腈-水(體積比11;流動相流速為1.0mL/min;檢測波長為360nm;進樣量為10L。1.3.2分離條件的確定(1洗脫條件的選擇。選擇等度洗脫和梯度洗脫兩種洗脫方式。(2pH值。流動相的pH值直接影響氨基酸的分離效果,選擇流動相的pH值

10、為4.0,4.2,6.4,6.6,7.0;樣品衍生物水解液的pH值為6.5,7.0,7.5,8.0,8.5進行二因素試驗。(3衍生化試劑的用量。以DNFB為衍生化試劑,分別加入含10mL/L的DNFB的乙腈溶液0.1,0.5,1.0, 2.0mL進行試驗。(4柱溫。以柱溫2025進行試驗。1.3.3工作曲線的繪制及檢出限的確定吸取質量濃度為100mg/L的羥脯氨酸標準工作液2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mL,分別用超純水定容至100mL,制成質量濃度分別為2.0,4.0、6.0、8.0、10.0mg/L的羥脯氨酸標準工作溶液。取1mL羥脯氨酸標準工作溶液,置于10mL容量瓶中,加入濃

11、度為0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液1.0mL及含10mL/L的2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液1.0mL,置于60水浴中,避光加熱45min,冷卻至室溫,用濃度為0.01mol/L的磷酸二氫鉀溶液(pH=7.0稀釋至刻度,搖勻。使用0.45m濾膜過濾后,得樣品衍生物溶液。取10L進行測定。以峰面積對羥脯氨酸的質量濃度進行線性回歸,求線性回歸方程和相關系數。以3倍信噪比求最低檢出限。1.3.4精密度試驗對同一羥脯氨酸標準品溶液和同一測定樣品溶液重復測定5次,記錄峰面積和保留時間,求測定結果的相對標準偏差。1.3.5方法準確度(加標回收率首先測定摻加膠原水解蛋白乳中羥脯氨酸的質量濃度,然后按線性范圍內

12、低、中、高3個濃度進行標準加放,按1.3.4的方法進行試驗,測定加入后總的羥脯氨酸的質量濃度,然后用加入后總量減去正常的質量分數,再除以標準加入量,得到回收率,計算公式為回收率=標準加入后總量-正常量標準加入量100%1.3.6HACP蛋白質質量分數和Hyp質量濃度的測定粗蛋白的測定按GB5009.5-2003中第一法,即凱氏定氮法測定。羥脯氨酸的測定方法如下:準確稱取膠原水解蛋白粉8.80mg放入安瓿瓶中,加入2mL濃度為6mol/L的鹽酸,在氮氣保護下密封,110水解24h后,冷卻至室溫,用濃度為10mol/L的NaOH溶液中和至中性,以濃度為0.01mol/L的磷酸二氫鉀溶液定容至10m

13、L,得到樣品水解液。經0.22m濾膜過濾,棄去前5滴,4冰箱備用。按照1.3.3的試驗方法進行測定,以保留時間定性,峰面積外標法定量,用化學工作站進行數據處理。樣品中羥脯氨酸質量濃度按如下公式進行計算Hyp=C10F式中:C為標準曲線上對應的羥脯氨酸質量濃度;F為稀釋倍數;m為樣品質量。羥脯氨酸質量分數和膠原水解蛋白粉質量分數之間的換算系數的計算公式為f=1/Hyp含量式中:f為換算系數;Hyp為羥脯氨酸質量濃度。1.3.7牛乳中摻加膠原水解蛋白溶液的檢測精確稱取3.62g膠原水解蛋白粉,定容至100mL,混勻,此為膠原水解蛋白溶液。取0.1mL此溶液加入9.9mL牛乳混勻,此溶液即為摻加1%

14、膠原水解蛋白溶液的牛乳。同理,再分別配制摻加質量分數為2%,3%, 4%,5%膠原水解蛋白溶液的牛乳。取自制的摻加不同比例膠原水解蛋白的乳1mL按照1.3.6的方法處理,再按照1.3.3的方法進行測定,以保留時間定性,峰面積外標法定量,用化學工作站進行數據處理。由測得的羥脯氨酸的質量濃度乘以換算系數f即可得牛乳中摻加膠原水解蛋白的質量分數。2結果與分析2.1分離條件的確定2.1.1梯度洗脫條件的確定以濃度為0.05mol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH=6.5,含10mL/L四氫呋喃為流動相A,乙腈-水(體積比為11為流動相B,采用梯度洗脫程序,比較流動相配比對分離效果的影響。試驗結果表明,當初始流動

15、相B 的比例較大時,羥脯氨酸與絲氨酸不易分離,流動相BInspection Methods測定方法的比例較小時,峰型對稱性差,分離效果也不好。初始流動相B的比例占流動相的16%較合適,以后逐漸增加流動相B的比例,使疏水性氨基酸得到分離,從而使其他的氨基酸達到基線分離。流動相B的梯度洗脫程序為06min,16%;612min,16%24%;1218min,24% 30%;1830min,30%40%;3037min,40%50%;37 42min,50%98%;4250min,98%80%;5055min, 80%16%;5560min,16%。采用上述條件獲得的峰譜圖效果較好,應用上述條件獲得

16、的羥脯氨酸標準品梯度洗脫的色譜圖及膠原水解蛋白溶液的色譜圖分別如圖1和圖2所示。圖1羥脯氨酸標準品的色譜圖圖2膠原水解蛋白溶液的色譜圖2.1.2pH值的選擇流動相的pH值直接影響氨基酸的分離效果,選擇流動相的pH值分別為4.0,4.2,6.4,6.6,7.0,7.5,樣品衍生物水解液的pH值為7.0,7.5,8.0,8.5,進行兩因子交叉試驗。結果表明,流動相的pH值小于6.4時,保留時間增長,峰面積減小,靈敏度降低。流動相的pH值大于6.6時,保留時間縮短,峰面積增大,色譜峰拖尾。樣品衍生物的pH值大于8.0時,色譜峰形對稱性不好,影響積分效果。試驗表明,流動相的pH值為6.46.6時,樣品

17、衍生物溶液的pH值為7.58.0,分離效果最佳。本研究選擇pH值為6.5。2.1.3衍生化試劑的用量以DNFB為衍生化試劑,分別加入含10mL/L的DNFB的乙腈溶液0.1,0.5,1.0,2.0mL進行試驗。結果表明,加入量為0.1mL和0.5mL時,衍生物產率低,且衍生物的穩(wěn)定性較差;加入量為2.0mL時,絲氨酸與DNFB副產物(DNP-HO的峰面積太大,影響各組分的分離度及保留時間;加入量為1.0mL時,衍生化反應完全且分離效果較理想。本研究選用含10mL/L DNFB的乙腈溶液1.0mL進行衍生化。2.1.4柱溫以柱溫為2025進行試驗,結果表明,當柱溫大于24時,異亮氨酸與亮氨酸以及

18、苯丙氨酸與組氨酸分離效果不好;當柱溫為2023時,分離效果較好。本研究柱溫選為21。2.2工作曲線及檢出限將羥脯氨酸標準工作溶液,按2.1確定的分離條件上機測定,以峰面積對羥脯氨酸的濃度進行線性回歸,其線性回歸方程為y=5.18105x-59.13(R2=0.9997。式中:y為峰面積;x為羥脯氨酸質量濃度。結果表明,Hyp的質量濃度在2.010.0mg/L的范圍內,質量濃度與其峰面積呈線性關系。以3倍信噪比求得對羥脯氨酸的檢出限為2.5mg/L。2.3精密度試驗按照1.3.4的方法進行試驗,將質量濃度為6.0mg/L 的羥脯氨酸標準品連續(xù)測定7次,記錄峰面積。求得峰面積的相對標準偏差(RSD

19、為1.62%,表明儀器的精密度良好。對摻加膠原水解蛋白溶液的牛乳連續(xù)取樣測定7次,記錄峰面積,求得峰面積的相對標準偏差(RSD為3.01%,保留時間的標準偏差(RSD1.21%。表明方法精密度良好。2.4準確度試驗按照1.3.5的方法進行回收率試驗,所得結果如表1所示。由表1可以看出,回收率在93.47%101.20%之間,即用本方法測定羥脯氨酸質量濃度的準確度較高,可滿足試驗要求。2.5HACP蛋白質質量分數和Hyp質量濃度的檢測結果按照1.3.6方法測得膠原水解蛋白粉的蛋白質質量分數為83.02%0.67%,測得膠原水解蛋白粉的羥脯氨酸質量濃度為109.80.1g/L。羥脯氨酸占正常膠原蛋

20、白蛋白質的百分比在12%14%之間,本研究測得羥樣品牛乳摻加1%膠原水解蛋白溶液的牛乳摻加2%膠原水解蛋白溶液的牛乳摻加3%膠原水解蛋白溶液的牛乳摻加4%膠原水解蛋白溶液的牛乳摻加5%膠原水解蛋白溶液的牛乳本底值/(mgL-10.003.987.8911.7915.9220.08加標量/(mgL-10.250.500.751.001.251.50測定值/(mgL-10.2534.4658.58112.75017.04021.430回收率/%101.2095.0093.4796.0089.6090.00表1回收率試驗結果測定方法Inspection Methods脯氨酸占膠原水解蛋白蛋白質的百分

21、比約為13.22%,符合羥脯氨酸在膠原蛋白中的含量。因此,計算得出羥脯氨酸和膠原水解蛋白之間的換算系數f為7.56。2.6牛乳中摻加膠原水解蛋白的檢測結果按照1.3.7的方法在牛乳中摻加膠原水解蛋白溶液,然后測定其中羥脯氨酸的量,結果如表2所示。由表2的可以看出,牛乳中羥脯氨酸質量濃度與膠原水解蛋白溶液的質量分數呈正相關,羥脯氨酸濃度變化可以反映牛乳中摻加的膠原水解蛋白的情況。由測得的羥脯氨酸含量乘以換算系數f,即可得出乳中摻加的膠原水解蛋白粉的量。本研究中編號由16這6個樣品摻加蛋白質質量分數為3%的膠原水解蛋白溶液分別為1%,2%,3%,4%,5%;經計算實際摻加的膠原水解蛋白粉的量分別為

22、0.0301,0.0601,0.0902,0.1202, 0.1503g。經試驗測得的羥脯氨酸的量再乘以換算系數f后所得到的摻加膠原水解蛋白粉的量分別為0.0302,0.0598,0.0897,0.1204,0.1494g。實際摻加的膠原水解蛋白粉的量與由實驗測得羥脯氨酸的量再乘以換算系數f所得到的膠原水解蛋白粉的量差異不顯著(p0.05。3討論乳蛋白是乳中最重要的營養(yǎng)成分之一,其質量分數已成為許多牛乳收購計價系統(tǒng)的基準。由于國標法對蛋白的檢測是通過檢測樣品含氮量而得到的。因此,僅通過檢測蛋白質質量分數并不能分辨是否在牛乳中摻加了非乳蛋白質。在堿性介質下,Hyp與DNFB-乙腈溶液混合振搖,即

23、生成DNP-羥脯氨酸,是比較穩(wěn)定的衍生物,可直接進樣測定,過量的DNFB對分析沒有影響,衍生物在360nm波長處有最大吸收峰,并且性質較穩(wěn)定,室溫放置36h后測定組分保持穩(wěn)定。本研究衍生劑DNFB的加入量是衍生化是否進行徹底的關鍵,DNFB的加入量應為分析氨基酸量5倍以上,才能得到徹底的衍生物。配制的對照品溶液置棕色瓶中于4冰箱存放可穩(wěn)定60d。本研究采用DNFB為衍生試劑,Hyp可以與DNFB 直接反應,采用柱前衍生的反相色譜法,操作簡便,而且不需要增加柱后反應系統(tǒng)。對線性關系、回收率及重復性進行考察,結果表明,線性關系良好,其回收率在93.47%101.20%之間,變異系數為1.62%,說明本試驗準確度及重現性都取得了令人滿意的效果。分析可在15min內完成。該法對羥脯氨酸的檢出限為2.5mg/L,即在牛乳中摻加質量濃度為18.9mg/L的膠原水解蛋白就可檢測到。該法的缺點是:需要進行衍生處理,衍生試劑影響測得結果;不適用于現場檢測,適用于一般實驗室及檢測部門使用。4結論本研究建立了2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白,其回收率在93.47%101.20%之間,變異系數為1.62%,說明其準確度及精密度都達到了分析的要求