放線菌抗生素的發(fā)酵及其目的產(chǎn)物的提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、*-放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產(chǎn)物的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 、熟悉掌握土壤中分離抗生素及培養(yǎng)方法2 、了解和掌握種子制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)和方法3 、了解抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律和代謝調(diào)控理論4 、了解小型發(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu)5 、熟悉掌握小型發(fā)酵罐的使用方法和保養(yǎng)6.掌握抗生素生物效價(jià)測(cè)定的原理和方法；7. 掌握管碟法測(cè)定抗生素生物效價(jià)相關(guān)的操作方法。8.掌握放線菌次級(jí)代謝物的初步純化及牛津杯實(shí)驗(yàn)的基本原理和操作技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理 發(fā)酵罐是進(jìn)行液體發(fā)酵的特殊設(shè)備。生產(chǎn)上使用的發(fā)酵罐容積大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供實(shí)驗(yàn)室使用的小型發(fā)酵罐，其容積可從約 lL 至數(shù)百升或稍大些。一般來(lái)說(shuō)，5L 以下是用耐壓玻璃制作

2、罐體， 5L 以上用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發(fā)酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動(dòng)地調(diào)控試驗(yàn)所需要的培養(yǎng)條件，是微生物學(xué)、遺傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等科學(xué)研究所必需的設(shè)備?？股兀?antibiotics）是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物， 能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)?，F(xiàn)*-臨床常用的抗生素有轉(zhuǎn)基因工程菌 培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物 。放線菌發(fā)酵結(jié)束后， 次級(jí)代謝物可能與菌體結(jié)合， 工業(yè)上常采用草酸或磷酸等酸化劑處理， 釋放與菌體結(jié)合的次級(jí)代謝物， 并采用加熱發(fā)酵液 70 ， 2 min 使

3、蛋白凝固，所得酸性濾液，在經(jīng)堿處理，進(jìn)一步去除蛋白?？股氐男r(jià)常采用微生物學(xué)方法測(cè)定， 它是利用抗生素對(duì)特定的微生物具有抗菌活性的原理來(lái)測(cè)定抗生素效價(jià)的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效價(jià)測(cè)定的國(guó)際通用方法，我國(guó)藥典也采用此法。管碟法是根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用， 比較標(biāo)準(zhǔn)品和檢品兩者對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌圈大小來(lái)測(cè)定供試品的效價(jià)。 管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗(yàn)菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內(nèi)徑 6.0 ±0.l mm ，外徑 8.0 ±0.l mm ，高 10±0. lmm ），管內(nèi)放人標(biāo)準(zhǔn)品和檢品的溶液， 經(jīng) 1618 小時(shí)恒溫培養(yǎng)， 當(dāng)抗生

4、素在菌層培養(yǎng)基中擴(kuò)散時(shí)， 會(huì)形成抗生素濃度由高到低的自然梯度， 即擴(kuò)散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到或高于 MIC（最低抑制濃度）時(shí)，試驗(yàn)菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的無(wú)菌生長(zhǎng)的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。根據(jù)擴(kuò)散定律的推導(dǎo)，抗生素總量的對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系， 比較抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與檢品的抑菌圈大小，可計(jì)算出抗生素的效價(jià)。常用的管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經(jīng)列入藥典。二劑量法系將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品各稀釋成一定濃度比*-例（ 2:1 或 4:1 ）的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根據(jù)抗生素濃度對(duì)數(shù)和抑菌圈直徑成直線關(guān)系的原理來(lái)計(jì)算供

5、試品效價(jià)。取含菌層的雙層平板培養(yǎng)基，每個(gè)平板表面放置 4 個(gè)小鋼管，管內(nèi)分別放入供試品高、低劑量和標(biāo)準(zhǔn)品高、低劑量溶液。先測(cè)量出四點(diǎn)的抑菌圈直徑，按下列公式計(jì)算出檢品的效價(jià)。（1）求出 W和 V： W=（SH+UH）- （SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）- （SH+SL）(式 2.10-2)式中： UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑；UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑；SH：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量之抑菌圈直徑；SL：標(biāo)準(zhǔn)品低劑量之抑菌圈直徑；（2）求出：=D·antilog（IV/W）(式 2.10-3)式中：供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比；D：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1I：高

6、低劑量之比的對(duì)數(shù)，即log2或log4。求出Pr：Pr=Ar×( 式 2.10-4)式中： Pr：供試品實(shí)際單位數(shù)；Ar：供試品標(biāo)示量或估計(jì)單位甲醛滴定法測(cè)定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸為兩性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。用甲醛處理氨基酸,甲醛與氨基結(jié)合 ,可形成羥甲基衍生物，使NH3+ 上的 H+游離出來(lái)，這樣就可*-用堿滴定 NH3+ 放出的 H+，從而計(jì)算出氨基氮含量。如樣品中只含有某一種已知氨基酸， 由甲醛滴定的結(jié)果即可算出氨基氮的含量。如果樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白質(zhì)水解物），則滴定結(jié)果不能作為氨基酸的定量依據(jù)。甲醛滴定法常用于測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度，隨著水解

7、程度的增加， 滴定值增加，當(dāng)水解完全后，滴定值保持恒定。甲基紅的變色范圍是PH4.46.2, 意思是說(shuō) :1. 其 pH值在 4.46.2 區(qū)間時(shí) , 呈橙色 ,2. 其 pH值 4.4 時(shí), 呈紅色 , 因是靠近酸性強(qiáng)的一邊時(shí)的顏色 ,故又稱之為酸色。3. 其 pH值 6.2 時(shí), 呈黃色，因是靠近堿性強(qiáng)的一邊時(shí)的顏色 ,故又稱之為堿色二、儀器與材料（一）培養(yǎng)基高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0gNaCl 0.5g KNO3 1.0gK HPO 0.5gMgSO.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g244蒸餾水 1000ml ，PH 7.4 ，發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：淀粉 3%,葡萄糖

8、 2%, 黃豆餅粉 2.5%, 蛋白胨 0.5% ,酵母粉 0.5%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%,KH 2PO4, 0.03%,CaCO3 0.4%, PH 6.0。黃豆餅粉4g, 淀粉 10g, 酵母粉 0.25 g , 蛋白胨 1.5g,*-MgSO4 0.025 g,CaCO3 0.4g,(NH4) 2SO4 0.3 g,-淀粉酶（ 105u/ml） 0.01ml.100mlPH7.4-7.6可溶性淀粉2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g，MgSO4.7H2O0.05g， FeSO4.7H2O0.001g，加蒸餾水至 1

9、00ml，PH 7.4，牛肉膏蛋白胨牛肉膏(5.0g），蛋白胨（ 10.0g）， NaCl（5g），蒸餾水（ 1000mL）， pH 7.27.4發(fā)酵罐培養(yǎng)基 (2L) ：黃豆餅粉80g淀粉200g酵母粉5 g蛋白胨30gMgSO40.5 gCaCO38g(NH4) 2SO46 g?- 淀粉酶（ 105u/ml ） 0.2ml（二 ) 流加補(bǔ)料碳源：葡萄糖（ 10%）300ml, 控制 1%；2000*1%=20g,200ml氮源：硫酸銨（ 10%）250ml, 控制 16%調(diào) PH值： 0.1MHCl0.1MNaOH（三 ) 分析指標(biāo)及方法所用試劑及溶液測(cè)殘?zhí)?-DNS法1. 3，5 二硝基

10、水楊酸試劑（ DNS 試劑）：將 6.3g 的 3，5 二硝基水楊酸和 2molNaOH 溶液加到 500ml 含有 182g 酒石酸鉀鈉的熱*-水溶液中，再加 5g 結(jié)晶苯酚和 5g 亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到 1000ml2. 1.0mg/ml 葡萄糖溶液：稱取 1g 葡萄糖，加蒸餾水定容到1L。3. 6mol/l 氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉 24g,加蒸餾水定容到100ml。4. 6mol/l 的鹽酸：取濃鹽酸 49.68ml,加蒸餾水定容到 100ml。測(cè)殘氮的方法 - 甲醛法1. 甲基紅： 0.1g 甲基紅，用 95%乙醇定容 100ml。2. 0.3mol/LHCL：

11、取濃鹽酸 2.48ml,加蒸餾水定容到 100ml。3. 0.02858mol/L NaOH：稱 0.11432g, 定容 100ml。4. 1% 酚酞指示劑：稱取 1g 酚酞指示劑粉末。溶于 100ml 95%乙醇溶液中。5. 95% 乙醇：取乙醇 96ml, 倒入 100ml 容量瓶中定容值 100ml。6. 18% 中性甲醛：取 48ml 38%的甲醛加入小于 100ml 容量瓶，往溶液中加兩滴酚酞用氫氧化鈉滴定剛好變紅，定容到100ml。（四）器材玻璃試管、 試管架、吸管（ 1ml，2ml，10ml）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（ 250 ml，500ml）、量筒（ 250m

12、l，500ml，1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫箱、臺(tái)秤、 5L- 發(fā)酵罐，無(wú)菌室、培養(yǎng)皿（直徑9 cm）、陶瓦蓋、鋼管、鋼管放置器、恒溫培養(yǎng)室、滅菌刻度吸管、玻璃容器、*-稱量管、毛細(xì)滴管、天平、直尺或游標(biāo)卡尺、超凈工作臺(tái)，無(wú)菌培養(yǎng)皿，酒精燈，牛津杯，鑷子，移液器等等（五） . 生物效價(jià)測(cè)定所需材料（1）菌種：大腸桿菌（ Escherichia coli ），菌液濃度約為 106 個(gè)/mL。菌株保存的時(shí)間過(guò)久，影響其對(duì)抗生素的敏感度，導(dǎo)致抑菌圈變大、模糊或者出現(xiàn)雙圈。如若菌株不純，也會(huì)造成這樣的結(jié)果。因此，菌液在使用一段時(shí)間后， 可以重新配制純化或

13、者減小原來(lái)菌液在使用中的稀釋倍數(shù)。（ 2）抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品：頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)品和供試品。（ 3）培養(yǎng)基：效價(jià)檢定用培養(yǎng)基 1 號(hào)。（4）無(wú)菌緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59g ，磷酸二氫鉀 0.41g ，加水1000mL，即為 pH 7.8 的磷酸鹽緩沖液。制備緩沖液的試劑應(yīng)為分析純，配制后的緩沖液應(yīng)澄清，分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121蒸氣滅菌30 min 備用。（ 5）草酸， 10 M NaOH四、實(shí)驗(yàn)步驟篩選高產(chǎn)放線菌從土壤里篩選出高產(chǎn)放線菌，于斜面培養(yǎng)基中保藏接種在超凈工作臺(tái)上，將長(zhǎng)好的斜面孢子用無(wú)菌接種針挖塊約20.5 ×1cm ，接種于滅過(guò)菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)*-將接種好的

14、種子搖瓶于28恒溫室搖床上，轉(zhuǎn)速為200r/min ，培養(yǎng) 48 小時(shí)左右。實(shí)罐滅菌1 、將冷凝水管路斷開(kāi)，拔下電極，打開(kāi)罐蓋，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐及補(bǔ)料瓶，易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基盡量不要超過(guò)兩升。2 、連接管路：取樣管路連接，補(bǔ)料管路連接；空氣過(guò)濾器用硅膠管與罐蓋空氣管連接， 并用彈簧夾夾緊； 排氣口與過(guò)濾器用硅膠管連接；安裝溫度電極、 pH 電極、溶氧電極， pH 電極用們帽蓋緊電極上端口，溶氧 電極用鋁鉑紙包裹電極上端口，防止受潮。蓋緊其它罐蓋接口。3 、提起玻璃罐體及補(bǔ)料瓶放入滅菌鍋，蓋好牛皮紙，蓋好鍋蓋，確定發(fā)酵溫度及時(shí)間。4 、滅菌結(jié)束后，盡快將罐放回原位并盡快通入空氣。發(fā)酵操作1

15、、將滅菌后的罐體放回原位，連接冷凝水管路，通入冷凝水，連接通氣管路，調(diào)整通氣量至 35L/min 。2 、將溫度電極、 pH電極、溶氧電極與控制器連接。3 、補(bǔ)料管連接：打開(kāi)補(bǔ)料蠕動(dòng)泵防護(hù)蓋，搬開(kāi)進(jìn)出口處的白色管夾，將硅膠管嵌入入口處的管夾并夾緊，用手轉(zhuǎn)動(dòng)泵頭，將硅膠管沿凹槽安裝直至出口處， 開(kāi)手動(dòng)開(kāi)關(guān)約十秒后夾緊出口處管夾， 關(guān)手動(dòng)開(kāi)關(guān)；將酒精棉球放在罐蓋補(bǔ)料口內(nèi)，將針頭插入并穿透密封蓋；打開(kāi)蠕動(dòng)泵手動(dòng)開(kāi)關(guān)，使輸液管中充滿料液，置于自動(dòng)狀態(tài)。*-接種將培養(yǎng) 48 小時(shí)的搖瓶種子接種于發(fā)酵罐中， 使用接種圈放置酒精棉點(diǎn)燃，進(jìn)行無(wú)菌接種，接入100ml 種子。接種后立即進(jìn)行第一次取樣。發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)

16、酵過(guò)程的測(cè)定：發(fā)酵液狀態(tài)觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)發(fā)酵中殘?zhí)堑臏y(cè)定 -DNS法：1.取 1.0mg/ml 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按下表加入試劑。沸水浴加熱 5min，冷水冷卻定容至25ml 搖勻，在 520nm 按波長(zhǎng)測(cè)吸光度。編號(hào)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 /ml水 /ml溶液糖含量 /mgDNS 試劑 /ml00201.510.21.80.21.520.41.60.41.530.61.40.61.540.81.20.81.551.01.01.01.561.20.81.21.571.40.61.41.581.60.41.61.52.取發(fā)酵液 0.5ml 置于 50ml 容量瓶中，加 6mol/l 的鹽酸

17、溶液*-2ml，在沸水溶液中加熱 15min 水解，冷水冷卻后及時(shí) 6mol/l 氫氧化鈉溶液 1.8ml，并定容到 50ml 的總糖水解液。3.取總糖水解液 2ml 于 25ml 比色管中，加入 DNS 試劑 1.5ml 沸水浴中加熱 5min，冷水冷卻后定容至 25ml 搖勻，以空白作對(duì)照在 520nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度。氨基酸氮的測(cè)定：甲醛法 ( 陳鈞鳴和徐玲娣 ,1991) 。取 2ml 發(fā)酵液濾液于三角瓶?jī)?nèi) , 加蒸餾水 10ml, 甲基紅指示劑 2 滴, 用 O.3MHCI 調(diào)節(jié) pH至溶液呈紅色 , 再用 0.02858MNaOH溶液調(diào) pH至溶液呈橙色( 中性 ), 加 18%中性

18、甲醛溶液 4ml, 搖勻 , 靜置 10min, 加 l%酚酞指示劑8 滴, 用 0.02858NNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。氨基氮的計(jì)算公式為 : 氨基氮 (mg/l00ml)= 滴定體積 *20。放線菌次級(jí)代謝物的初步純化及牛津杯實(shí)驗(yàn)的1 、配制培養(yǎng)基高壓滅菌。2 、倒平板。3 、涂布指示菌。4 、以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基表面直接垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。5 、收集發(fā)酵液，緩緩加入草酸將發(fā)酵液酸化至 pH 1.4- 3.0 左右， 70 ， 2 min ， 以 10000 rpm 離心 20 min 。6 、取上清加入水稀釋 20%左右，在 4，用 10 M Na

19、OH中和至pH6.4- 6.8 。7、吸取中和液100 L 加入牛津杯中， 37培養(yǎng) 16hr ，觀察*-結(jié)果。效價(jià)測(cè)定1. 稱量稱量前，將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品從冰箱取出， 使與室溫平衡，供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少 30 min 方可稱取。供試品與標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用同一天平；吸濕性較強(qiáng)的抗生素在稱量前 12 小時(shí)更換天平內(nèi)干燥劑。標(biāo)準(zhǔn)品稱量不可少于 20 mg，取樣后立即將稱量瓶或適宜的容器及被稱物蓋好，以免吸水稱樣量的計(jì)算 W=V*C/P ( 式 2.10-4)式中： W：需稱取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的重量（mg）V：溶解標(biāo)準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時(shí)用容量瓶的體積量（ mL）C ：標(biāo)準(zhǔn)品或供試品高劑量的濃度（

20、U/mL， g/mL）P ：標(biāo)準(zhǔn)品的純度或供試品的估計(jì)效價(jià)（ U/mg，g/mg）2. 稀釋從冰箱中取出的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，必須先在室溫放置， 使其溫度達(dá)到室溫后，方可量取。標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液的稀釋?xiě)?yīng)采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2 mL，稀釋步驟一般不超過(guò)3 步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23 次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開(kāi)始放溶液。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶，（預(yù)計(jì)不夠時(shí)，應(yīng)事先與另一瓶混勻后再用） ，以免因 pH 或濃度不同影響*-預(yù)定結(jié)果。稀釋時(shí)，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下， 再準(zhǔn)確補(bǔ)加至刻度。 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品高低濃度之比為 2:1 或 4:1 ，但所選用的濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。3. 雙碟制備在超凈工作臺(tái)上，用滅菌大口吸