第六章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)-黃秀梅

1、第六章第六章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù)Plant Protoplast Fusion What 基本原理基本原理 Why 技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用 How 技術(shù)方法技術(shù)方法微微 絲絲葉綠體葉綠體線粒體線粒體質(zhì)質(zhì) 膜膜液液 泡泡細(xì)胞核細(xì)胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微微 管管細(xì)胞壁細(xì)胞壁高爾基體高爾基體細(xì)胞壁由三種主要成分構(gòu)成細(xì)胞壁由三種主要成分構(gòu)成纖維素纖維素25-50%、半纖維素半纖維素53%和果膠和果膠5% What 基本原理基本原理 去除植物細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體去除植物細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體 誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成雜種細(xì)胞誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成雜種細(xì)胞 篩選，培養(yǎng)，促進(jìn)雜種細(xì)胞分裂，分化

2、篩選，培養(yǎng)，促進(jìn)雜種細(xì)胞分裂，分化 從細(xì)胞團(tuán)，愈傷組織到最后成株從細(xì)胞團(tuán)，愈傷組織到最后成株植物原生質(zhì)體融合基本過(guò)程植物原生質(zhì)體融合基本過(guò)程 Why 技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用植物原生質(zhì)體融合的意義：克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造條件 How 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)方法植物原生質(zhì)體融合技術(shù)方法 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的制備 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體的融合植物原生質(zhì)體的融合1、原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義、原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義2、原生質(zhì)體材料來(lái)源、原生質(zhì)體材料來(lái)源3、原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的分離4、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體

3、的純化 概念：概念： 除去植物細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，稱為原生質(zhì)體 植物葉片植物葉片取材容易取材容易比較容易用酶解法分離比較容易用酶解法分離 植物根尖組織植物根尖組織可由各種植物的種子萌發(fā)后可由各種植物的種子萌發(fā)后取得取得 植物花粉植物花粉產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體 愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞壁容易解離細(xì)胞壁容易解離與分離試劑相與分離試劑相同同與分離試劑相同與分離試劑相同F(xiàn)DA法的原理法的原理vFDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出自由出入細(xì)胞膜入細(xì)胞膜。v在在活活細(xì)胞中，細(xì)胞中，F(xiàn)DA被酯酶被酯酶裂解裂解，釋放出有，釋放

4、出有極性的熒極性的熒光素光素。v熒光素?zé)晒馑夭荒茏杂纱┰讲荒茏杂纱┰劫|(zhì)膜，在活細(xì)胞中積累。質(zhì)膜，在活細(xì)胞中積累。v熒光素在熒光素在死細(xì)胞中不能積累死細(xì)胞中不能積累。v在在UV照射下照射下，活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出，活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出綠色熒光綠色熒光。FDA熒光素?zé)晒馑鼗罴?xì)胞活細(xì)胞死細(xì)胞死細(xì)胞請(qǐng)思考請(qǐng)思考活細(xì)胞活細(xì)胞死細(xì)胞死細(xì)胞FDA先用丙酮配成先用丙酮配成0.5%的母液，終濃度為的母液，終濃度為0.01%原生質(zhì)體分離純化流程圖原生質(zhì)體分離純化流程圖 淺層液體培養(yǎng)法：淺層液體培養(yǎng)法：在培養(yǎng)皿或三角瓶中注入34ml原生質(zhì)體培養(yǎng)液，然后將純凈的原生質(zhì)體，按一定的細(xì)胞密度注入并進(jìn)行培養(yǎng) 固體培養(yǎng)法固體培

5、養(yǎng)法 原生質(zhì)體按照一定細(xì)胞起始密度，均勻分布于薄層固體培養(yǎng)基中 此法優(yōu)點(diǎn)有利于對(duì)單個(gè)原生質(zhì)體的胞壁再生和對(duì)細(xì)胞團(tuán)形成的全過(guò)程進(jìn)行定點(diǎn)觀察 雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法在固體培養(yǎng)基上，加入適宜原生質(zhì)體胞壁再生和細(xì)胞分裂的液體培養(yǎng)基細(xì)胞壁再生：細(xì)胞壁再生： 體積膨大，葉綠體重新排列，新的細(xì)胞壁開始合成，細(xì)胞由球形變成橢圓形。細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)：細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)： 一般在培養(yǎng)2-3天后細(xì)胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，DNA、蛋白質(zhì)等合成增加，細(xì)胞分裂，形成小的細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織或胚狀體。器官形成植株再生：器官形成植株再生： 從愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生 胚狀體發(fā)育原生質(zhì)體的活力原生質(zhì)體的活力 影響因素：制備原生質(zhì)體的方

6、法，滲透壓穩(wěn)定劑種類、濃度，質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類、濃度，溫度和保溫時(shí)間原生質(zhì)體密度原生質(zhì)體密度 起始密度一般為104-105 個(gè)/mL細(xì)胞壁再生速度細(xì)胞壁再生速度 植物種類和取材的生理狀態(tài)；培養(yǎng)細(xì)胞所處的時(shí)期；酶解時(shí)所用質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類原生質(zhì)體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境原生質(zhì)體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境 培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)的環(huán)境：光照、溫度、濕度 細(xì)胞融合細(xì)胞融合(cell fusion)(cell fusion)概念：概念： 又稱細(xì)胞雜交(cell hybridizaion)：離體條件下用人工的方法把不同的細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。 細(xì)胞融合的意義：細(xì)胞融合的意義： 克服種、屬以上植物有性雜交不親和性

7、障礙 為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造條件植物原生質(zhì)體融合基本過(guò)程植物原生質(zhì)體融合基本過(guò)程 鹽類融合法 高Ca2+和高pH值融合 聚乙二醇（PEG）融合法 PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法 電融合法A. 鹽類融合法鹽類融合法 鹽類融合劑種類鹽類融合劑種類硝酸鹽類：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2氯化物類：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2葡聚糖硫酸鹽類：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉 鹽類融合的優(yōu)缺點(diǎn)鹽類融合的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：鹽類融合劑對(duì)原生質(zhì)體的活力破壞力小缺點(diǎn)：融合頻率低，對(duì)液泡化發(fā)達(dá)的原生質(zhì)體不易誘發(fā)融合B. 高高Ca2+和高和高pH值融合值融合 Ca

8、2+濃度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5具體做法具體做法( (以煙草為例以煙草為例) ) 取分離、純化好的兩種親本原生質(zhì)體以1:1的比例混合; 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; 再用甘氨酸鈉緩沖pH值到10.5，成為融合液，同時(shí)在37下保溫0.5h; 用0.4mol/L甘露醇洗凈高CaCl2和高pH值； 兩種原生質(zhì)體的融合率達(dá)到10%。C. 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）融合法）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一種多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相對(duì)分子量200-20000之間 融合機(jī)制融合機(jī)制：

9、可能是由于帶有大量負(fù)電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷間在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著結(jié)合 用相對(duì)分子質(zhì)量為1540的PEG處理40-50 min；再用培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG最后洗去PEG，得到10%的異核體D. PEG與高與高Ca2+和高和高pH值結(jié)合融合法值結(jié)合融合法 先用PEG處理30min；（PEG是相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋） 然后用高Ca2+和高pH值液，稀釋PEG；（引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布，從而促進(jìn)了融合） 再用培養(yǎng)液洗去高Ca2+和高pH值PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過(guò)程誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過(guò)程E. 電融合法電融合法 原理：原理： 改變?cè)|(zhì)體質(zhì)膜表

10、面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)原生質(zhì)體的損害小，融合率高，重復(fù)性強(qiáng)；裝置精巧、方便簡(jiǎn)單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過(guò)程，免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程，誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。電融合基本過(guò)程將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室，微電極型只有一個(gè)小室，平行電極型有4個(gè)小室，兩電極間隔3mm，整個(gè)裝置放在一個(gè)培養(yǎng)皿中微電極型：用5-12微安的脈沖電流間斷刺激1-5毫秒，原生質(zhì)體在幾秒到幾十秒鐘的時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個(gè)個(gè)泡囊，經(jīng)點(diǎn)連接到面連接，最后形成融合體

11、,整個(gè)過(guò)程約10-30分平行多電極融合裝置法：經(jīng)過(guò)1兆赫如150V/cm交流電場(chǎng)發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場(chǎng)力的作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀。在適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的直流電脈沖(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，質(zhì)膜發(fā)生被擊穿，進(jìn)一步形成融合體細(xì)胞電融合過(guò)程細(xì)胞電融合過(guò)程原生質(zhì)體的融合過(guò)程包括原生質(zhì)體的融合過(guò)程包括3 3個(gè)主要階段個(gè)主要階段：1)兩個(gè)或多個(gè)原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；兩個(gè)或多個(gè)原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；2)2)局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合；局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合；3)3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。融合完成，形成球形的異核體或同核體。 PEGP

12、EG誘導(dǎo)法：誘導(dǎo)法：PEG規(guī)格、純度，作用時(shí)間 電誘導(dǎo)法：電誘導(dǎo)法：原生質(zhì)體密度交流電壓 交變電場(chǎng)的振幅頻率交變電場(chǎng)的處理時(shí)間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數(shù) A、融合體的類型、融合體的類型B、雜種細(xì)胞選擇的方法、雜種細(xì)胞選擇的方法C、細(xì)胞雜種的鑒定、細(xì)胞雜種的鑒定A、融合體的類型、融合體的類型 自體融合：自體融合：發(fā)生在親本原生質(zhì)體自身 異體融合異體融合諧和的細(xì)胞雜種諧和的細(xì)胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體部分諧和的細(xì)胞雜種部分諧和的細(xì)胞雜種：雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，便發(fā)生少量染色體的重組，然后進(jìn)入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種：親本的染色體全

13、部被排斥，但胞質(zhì)是雙親的嵌合細(xì)胞雜種嵌合細(xì)胞雜種：不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融合和胞質(zhì)融合，尚未發(fā)生核融合。雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細(xì)胞壁，最終形成嵌合體植物B、雜種細(xì)胞選擇的方法、雜種細(xì)胞選擇的方法 互補(bǔ)選擇法互補(bǔ)選擇法( (遺傳或抗性遺傳或抗性) )： 選擇一個(gè)葉綠體缺失突變體，這一突變體在限定培養(yǎng)基上，能分裂、分化形成植株。具有正常葉綠素的植株，在上述限定培養(yǎng)基上，則不能分裂形成大細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織） 可見(jiàn)標(biāo)記法：可見(jiàn)標(biāo)記法： 凹穴培養(yǎng)皿分離法：根據(jù)融合后異核體和親本原生質(zhì)體的形態(tài)特征之區(qū)別 微吸管分離法：用一種向吸管根據(jù)可見(jiàn)標(biāo)記吸取異核體，進(jìn)行“看護(hù)培養(yǎng)”，以獲得雜種植物

14、 生長(zhǎng)特性選擇法：生長(zhǎng)特性選擇法：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。 物理特性選擇法：物理特性選擇法：利用親本原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電脈差異率等差異選擇雜種。 其他方法：其他方法：如采用顯微操作技術(shù)也能把單個(gè)異核體分離出來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC）和和異硫氰酸羅丹明（異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發(fā)出分別發(fā)出綠色綠色和和紅色紅色 熒光染料法熒光染料法兩個(gè)親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光的熒兩個(gè)親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光的熒光染料進(jìn)行染色。光染料進(jìn)行染色。細(xì)胞分類器辨別和收集發(fā)兩種熒光的異核體。細(xì)胞分類器辨別和收集發(fā)兩種熒光

15、的異核體。但儀器價(jià)格昂貴，不常用。但儀器價(jià)格昂貴，不常用。C、細(xì)胞雜種的鑒定、細(xì)胞雜種的鑒定（1 1）雜種植物形態(tài)特征、特性鑒定）雜種植物形態(tài)特征、特性鑒定（2 2）雜種植物的核型分析）雜種植物的核型分析（3 3）同工酶分析）同工酶分析（4) 4) 分子標(biāo)記鑒定：分子標(biāo)記鑒定： RFLPRFLP鑒定、鑒定、RAPDRAPD 標(biāo)標(biāo)記鑒定記鑒定18條染色體條染色體36條染色體條染色體幾種細(xì)胞融合成功的例子幾種細(xì)胞融合成功的例子 融合生物種類融合生物種類 細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞來(lái)源 成功年代成功年代煙草兩個(gè)種間 葉葉 1972甘藍(lán)青菜 葉根 1972大豆馬唐草 愈傷組織葉 1972矮牽牛龍面花 葉花瓣 1973 大麥花生 種子種子 1974大麥大豆 葉懸浮細(xì)胞 1974小麥矮牽牛 葉花瓣 1974玉米大豆 葉懸浮細(xì)胞 1974大豆野碗豆 懸浮細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 1974大麥蠶豆 葉根 1975大豆草香木犀 懸浮細(xì)胞 葉 1976酵母菌雞 原生質(zhì)體血紅細(xì)胞 1976大豆煙草 懸浮細(xì)胞 葉 197