牛奶中酪蛋白的分離及鑒定

1、牛奶中活性物質(zhì)的分析牛奶中活性物質(zhì)的分析實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容v1牛奶中水分含量的測定牛奶中水分含量的測定v2牛奶中粗脂肪的提取與牛奶中粗脂肪的提取與測定測定v3牛奶中酪蛋白的提取牛奶中酪蛋白的提取v4蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量的測定（1）牛奶中水分含量的測定）牛奶中水分含量的測定 v水分是食品分析的重要項目之一。水分測定對于計算生產(chǎn)中的物料平衡，和實行工藝監(jiān)督等方面，有很重要的意義。各種食品水分的含量差別很大。例如，鮮果為69.7%-92.5%，鮮菜為79.7%-97.1%，鮮瘦肉52.6-77.4%，面粉12-14%。面包水分隨品種不同略有差異，一般為32-42%v水分測定法通?？煞譃橹苯臃ㄖ苯?/p>

2、法和間接法間接法兩類。 利用水分本身的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)測定水分的方法，叫做直接法，直接法，如重量法，蒸餾法和卡爾.費休法等； 利用食品的比重，折射率，電導(dǎo)，介電常數(shù)等物理性質(zhì)測定水分的方法，叫做間接法。間接法。測定水分的方法要根據(jù)食品的性質(zhì)和測定目的來選定一一 重量法重量法 凡操作過程中包括有稱量步驟的測定方法，統(tǒng)稱為重量法，如烘箱干燥法，紅外線干燥法，干燥劑法等。v 烘箱干燥法烘箱干燥法 在一定溫度和壓力條件下，將樣品加熱干燥，以排除其中水分的方法，叫做烘箱干燥法。它包括常壓烘箱法和真空烘箱干燥法。這種測定方法費時長，但操作簡便，應(yīng)用范圍較廣。 v 應(yīng)用本法測定水分的樣品應(yīng)符合下述條件：應(yīng)

3、用本法測定水分的樣品應(yīng)符合下述條件： (1)水分是唯一的揮發(fā)物質(zhì)； (2)水分的排除情況很完全； (3)食品中其他組分在加熱過程中由于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而引起的重量變化可以忽略。二二 材料與儀器材料與儀器v材料 全脂牛奶 層析濾紙v器材 常壓電熱烘箱 干燥器 電子分析天平三三 操作步驟操作步驟 v取一張12cm*12cm 70過夜烘干的層析濾紙，稱重，記為m1。準(zhǔn)確稱取一定量牛奶m2，滴于濾紙上，70 烘干后稱重，記為m3。計算水分含量。v干物質(zhì)質(zhì)量m4= m3 - m1v水分含量（%）=（ m2-m4）/m2100（2）粗脂肪的定量測定）粗脂肪的定量測定索氏提取法索氏提取法一一 、目的要求、目的要

4、求學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪的定量測定法索氏提取法二、原理二、原理v脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸結(jié)合成的脂類化合物, 能溶于脂溶性有機溶劑。v本實驗用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將脂肪提取出來，借蒸發(fā)除去溶劑后稱量。整個提取過程均在索氏提取器中進行。通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點為30C -60 C的石油醚。用此法提取的脂溶性物質(zhì)除脂肪外，還含有游離脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故稱為“粗脂肪”。三、三、 適用范圍與特點適用范圍與特點v適用于脂類含量較高，結(jié)合態(tài)脂類含量少或經(jīng)適用于脂類含量較高，結(jié)合態(tài)脂類含量少或經(jīng)水解處理過的，（結(jié)合態(tài)已轉(zhuǎn)變成游離態(tài)），水解處理過的

5、，（結(jié)合態(tài)已轉(zhuǎn)變成游離態(tài)），樣品應(yīng)能烘干，磨細，不易吸濕結(jié)塊。樣品應(yīng)能烘干，磨細，不易吸濕結(jié)塊。v此法經(jīng)典，對大多數(shù)樣品的測定結(jié)果比較可靠。此法經(jīng)典，對大多數(shù)樣品的測定結(jié)果比較可靠。但費時長（但費時長（816 h）溶劑用量大，需要專門）溶劑用量大，需要專門的儀器的儀器,索氏提取器。索氏提取器。 四四 材料、試劑與器材材料、試劑與器材v材料：全脂牛奶v試劑：乙醚v器材：索氏提取器、干燥箱、電子分析天平索氏提取器構(gòu)造索氏提取器構(gòu)造五、操作方法五、操作方法 1抽提筒的準(zhǔn)備抽提筒的準(zhǔn)備 2 抽提抽提 將測定完水分帶有干物質(zhì)的濾紙折成小包放入抽提筒，再放入索氏抽提器內(nèi)，連接已干燥至恒重（m5）的脂肪接受

6、瓶，由冷凝管上端加入無水乙醚，加量為接受瓶的23體積，于60水浴上加熱，使乙醚不斷的回流提取，一般視含油量高低提取612小時，至抽提完全為止（用濾紙試）。3 3 稱重稱重v取下接受瓶，回收乙醚，待接受瓶內(nèi)乙醚剩 1 2 ml 時，在水浴上蒸干，再于100105干燥 2小時，取出放干燥器內(nèi)冷卻30分鐘，稱重，并重復(fù)操作至恒重（m6）。v取出濾紙包，于戶外晾至無乙醚味，置入恒溫箱內(nèi)，烘干，然后移入干燥缸內(nèi)冷卻后稱重，重復(fù)操作至恒重（m7）。六六 結(jié)果處理結(jié)果處理v方法一 脂肪脂肪()(m6-m5) / m4 100m6接受瓶和脂肪的質(zhì)量，接受瓶和脂肪的質(zhì)量，g；m5接受瓶的質(zhì)量，接受瓶的質(zhì)量，g；

7、m4樣品的質(zhì)量樣品的質(zhì)量(如為測定水分如為測定水分 后的后的 樣品質(zhì)量計樣品質(zhì)量計)，g。v方法二脂肪脂肪()(m3-m7) / m4 100m3未抽提濾紙包的質(zhì)量，未抽提濾紙包的質(zhì)量，g；m7抽提后濾紙包的質(zhì)量，抽提后濾紙包的質(zhì)量，g；m4樣品的質(zhì)量樣品的質(zhì)量(如為測定水分如為測定水分 后的后的 樣品質(zhì)量計樣品質(zhì)量計)，g。七、注意事項七、注意事項v乙醚為易燃有機溶劑，實驗室應(yīng)保持通風(fēng)并禁止任何明火。v抽提用的乙醚或石油醚要求無水、無醇、無過氧化物，揮發(fā)殘渣含量低。因水和醇可導(dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶性鹽類、糖類等，使得測定結(jié)果偏高，被測樣品也要事先烘干。過氧化物會導(dǎo)致脂肪氧化，在烘干時也有

8、引起爆炸的危險。v裝樣品的濾紙筒一定要嚴(yán)密，不能往外漏樣品，也但不要包得太緊影響溶劑滲透。放入濾紙筒時高度不要超過回流彎管，否則超過彎管的樣品中的脂肪不能提盡，造成誤差。八、思考題八、思考題(1) 本實驗制備得到的是粗脂肪, 若要制備單一組分的脂類成分, 可用什么方法進一步處理？(2) 本實驗樣品制備時烘干為什么要避免過熱（3）酪蛋白的提?。├业鞍椎奶崛∫灰?、目的要求、目的要求v掌握一種提取酪蛋白的方法v掌握一種檢測牛乳質(zhì)量的方法二二 實驗原理實驗原理v酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì)，占乳蛋白的80%82%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲

9、氨酸的羥基相結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)可以檢測牛乳中是否摻假。v酪蛋白在其等電點時由于靜電和為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，將牛乳調(diào)到pH4.6，酪蛋白就可從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶于乙醇，這個性質(zhì)被用來從酪蛋白粗制劑中將脂類雜志除去。三三 儀器、原料和試劑儀器、原料和試劑v儀器：溫度計、布氏漏斗、pH試紙、抽濾瓶、水浴鍋、燒杯、 量筒、表面皿、天平、離心機等v原料：市售全脂牛奶v試劑：無水乙醇、無水乙醚 pH4.7乙酸鈉緩沖液0.2mol/L 乙醇、乙醚混合液：乙醇:乙醚=1

10、:1（體積比）四四 實驗步驟實驗步驟v1、酪蛋白等電點沉淀 將100mL牛乳放到500mL燒杯中，加熱到40，加入到同樣40的乙酸鈉緩沖液中，調(diào)pH達4.7。此時有絮狀的蛋白質(zhì)沉淀析出。將懸浮液冷卻至室溫，室溫放置分層 ，3000r/min離心15min，收集沉淀。v2、水洗 將pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍，洗滌粗制品三次，分別離心10分鐘，得到沉淀蛋白。 v3、去脂 將粗制品中加入10ml無水乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗滌沉淀兩次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白純品。

11、準(zhǔn)確稱重后，計算出每100mL牛乳所制備出的酪蛋白質(zhì)量（g/100mL），并與理論產(chǎn)量（3.5g/100mL）相比較，求出實際獲得百分率。五五 思考題思考題v用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗滌蛋白質(zhì)的順序是否可以變換？為什么？v試設(shè)計一個利用蛋白質(zhì)其他性質(zhì)提取蛋白質(zhì)的實驗六六 離心機的使用及注意事項離心機的使用及注意事項v離心機的工作原理離心機的工作原理：在離心力場的作用下，可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度，從而將不同的物質(zhì)分離。它是生化實驗中提取、分離、純化的常用設(shè)備，操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是平衡。v注意事項注意事項 1.檢查內(nèi)、外套管應(yīng)完整不漏，洗凈離心管； 2.待離心的物質(zhì)裝入離心管的量不應(yīng)超過

12、離心內(nèi)套管體積的2/3； 3.將一對離心管（含內(nèi)、外套管）放在臺秤上平衡； 4.檢查離心機正常后，將平衡好的離心管對稱的放在離心機中； 5.蓋好離心機蓋，打開電源開關(guān)，設(shè)置轉(zhuǎn)速與時間，開始離心。注意一定不能超過離心機的最大離心速度！離心結(jié)束后，待離心機停止運轉(zhuǎn)后，再打開機蓋，取出離心管，不許用手強行使離心機停止轉(zhuǎn) 6用完后，將內(nèi)外套管洗凈，倒立放置，使其干燥，并在使用的登記薄簽名。 7.使用過程中，如出現(xiàn)故障，一定請本室的實驗員排除，不許擅自處理（4）蛋白質(zhì)濃度的測定）蛋白質(zhì)濃度的測定考馬斯亮藍考馬斯亮藍染色法染色法一一 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膶W(xué)會用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)濃度 考馬斯亮藍能與蛋白

13、質(zhì)的疏水微區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性。考馬斯亮藍G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時呈藍色，最大吸收峰改變?yōu)?95nm,考馬斯亮藍G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏感度（比Lowry法靈敏4倍） 在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料考馬斯亮藍結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。 二二 實驗原理實驗原理Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO C

14、H2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+三三 實驗試劑與器材實驗試劑與器材 v試劑 0.9%NaCl溶液 標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml） 染液：考馬斯亮藍G250（0.01%） 樣品液：酪蛋白溶液v器材 漩渦混合器 試管 吸管 容量瓶 量筒 電子分析天平 比色皿 722型分光光度計 四、四、 操作方法操作方法 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取14支試管，分兩組按下表平行操作。試管編號 0 1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.9%NaCl溶液（mL）1.0 0.9 0.8 0.7 0.

15、6 0.5 0.4考馬斯亮藍試劑(mL) 4 4 4 4 4 4 4蛋白質(zhì)濃度(g/mL) 0 10 20 30 40 50 60 A595nm搖勻，1 h內(nèi)以0號試管為空白對照，在595nm處比色 OD595nm以O(shè)D595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 酪蛋白濃度的測定 稱取一定量的酪蛋白，用0.9%NaCl溶液溶解定容至一定體積（使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)）。測定方法同上，根據(jù)所測定的OD595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(g/mL)。五五 注意事項注意事項（1）如果測定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的

16、5-20 min內(nèi)測定光吸收，因為再這段時間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。（2）測定中，蛋白-染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上，但此復(fù)合物的吸附量可以忽略。測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。 （3）一些陽離子如K+、Na+、Mg2+、乙醇等物質(zhì)對測定無影響，而大量的去污劑如SDS等會嚴(yán)重干擾測定。六 722型分光光度計使用方法型分光光度計使用方法 1調(diào)整調(diào)整 （1）將靈敏度旋鈕調(diào)至“1”檔（放大倍率最小）。調(diào)波長調(diào)節(jié)器至所需波長。（2）開啟電源開關(guān)，指示燈亮，選擇開關(guān)置于“T”，調(diào)節(jié)透光率100%T旋鈕使數(shù)字顯示100.0左右，預(yù)熱20min .2校正校正 （1）打開吸收池暗室蓋（光門自動關(guān)閉），調(diào)節(jié)

17、0% T旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，蓋上吸收池蓋，將參比溶液置于光路，使光電管受光，調(diào)節(jié)透光率100%T旋鈕，使數(shù)學(xué)顯示為“100.0”。（2）如果顯示不到“100”，則可適當(dāng)增加電流放大器靈敏度檔數(shù)，但應(yīng)盡可能使用低檔數(shù)，這樣儀器將有更高的穩(wěn)定性。當(dāng)改變靈敏度 后必須重新校正“0”和“100”。（3）按（1）連續(xù)幾次調(diào)整“00.0”和“100.0”后，如將選擇開關(guān)置于“A”，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”，即可進行下面吸光度A的測量；如將選擇開關(guān)置于“C”，將標(biāo)準(zhǔn)溶液推入光路，調(diào)節(jié)濃度旋鈕，使得數(shù)字顯示值為已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度數(shù)值，即可進行下面濃度c的測量。3測定測定（） 吸光度的測量。將要測的試樣溶液推入光路，顯示值即為待測樣品的吸光度值。（） 濃度c的測量。將要測c試樣溶液推入光路，即可讀出待測樣品的濃度值c。4結(jié)束結(jié)束 測量完畢，關(guān)閉電源，將各調(diào)節(jié)