急性淋巴細(xì)胞白血病患兒骨髓基質(zhì)細(xì)胞的粘附行為

1、急性淋巴細(xì)胞白血病患兒骨髓基質(zhì)細(xì)胞的粘附行為摘要目的和方法：用MTT方法檢測了急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患兒骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)對正常骨髓造血細(xì)胞和淋巴瘤Raji細(xì)胞的粘附行為，用流式細(xì)胞儀檢測了BMSC表面的粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。結(jié)果：急性期組ALL BMSC對骨髓造血細(xì)胞的粘附能力明顯下降。長期緩解組ALL BMSC對腫瘤細(xì)胞的粘附能力明顯增高。急性期組ALL BMSC表面ICAM-1表達(dá)明顯降低。結(jié)論：ALL患兒BMSC對骨髓造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的粘附行為的異常，BMSC粘附行為的變化與細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)異常有關(guān)。主題詞白血病，淋巴細(xì)胞， 急性； 細(xì)胞粘附；

2、細(xì)胞粘附分子中分類號R733.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000-4718(2000)08-0713-05 Adhesion of bone marrow stromal cell in children with acute lymphoblastic leukemiaHUANG Yun,LI Xiao-yu，LIN Sui-zhen，LUO Xue-qun，QIN Zhao-yuan1(Department of Pediatrics of The First Affiliated Hospital Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Gua

3、ngzhou 510080, China)LI Shu-nong(Department of Pathophysiology, Sun Yat-sen University of Medical Science, Guangzhou 510089, China)AbstractAIM and METHOD: The adhesion behavior of bone marrow stromal cells(BMSC) in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL) to bone marrow mononuclear cells(BMMC

4、) and Raji cells were investigated by MTT method. The expression of adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 were detected by flow cytometry. RESULTS: The adhesion ability of BMSC in acute period of ALL to BMMC was lower than that of control group. The adhesion ability of BMSC in long term remission per

5、iod of ALL to Raji cells higher than that of control group. The expression of ICAM-1 on the surface of BMSC in acute period of ALL is much lower than that of control group. CONCLUSIONS: The adhesion of BMSC to BMMC or tumor cells in children with ALL was abnormal. The abnormal adhesion behavior migh

6、t be partially due to the changed expression of adhesion molecules on BMSC.MeSHLeukemia, lymphoblastic, acute; Cell adhesion; Cell adhesion molecules急性期骨髓造血抑制和緩解期微量殘余白血病細(xì)胞所致的復(fù)發(fā)是影響白血病治療的重要因素，但二者的發(fā)生機(jī)制還不明確，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell, BMSC)在其中的作用不清楚，我們檢測了處于不同治療階段的急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leuke

7、mia, ALL)患兒BMSC對骨髓造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的粘附能力及其表面粘附分子ICAM-1(CD54)、VCAM-1(CD106)的表達(dá)，以探討B(tài)MSC在白血病骨髓造血抑制和微量殘余白血病細(xì)胞發(fā)生中的作用，促進(jìn)白血病療效的進(jìn)一步提高。材料和方法一、病例選擇和標(biāo)本采集ALL患兒20例，經(jīng)骨髓檢查確診并進(jìn)行FAB分型、免疫學(xué)分型，用統(tǒng)一方案治療及隨訪，其中男性14例，女性6例；年齡2.513歲；根據(jù)患兒所處的疾病階段將患兒分為3組：急性期組：7例，患兒系初發(fā)或復(fù)發(fā)未治或誘導(dǎo)治療中尚未緩解；緩解組：7例，患兒經(jīng)誘導(dǎo)治療后緩解但持續(xù)緩解不足1年；長期緩解組：6例，患兒系治療后持續(xù)緩解1年以上。全部骨

8、髓均采自胸骨、髂前或髂后上嵴，肝素抗凝。對照組17例，為本院胸外科肺部疾患的病人，包括肺癌(11例)、支氣管擴(kuò)張癥(3例)、肺不張(2例)、結(jié)核球(1例)。肺癌患者骨質(zhì)未受侵犯，所有對照組病人外周血象正常，骨髓取自手術(shù)中切除的肋骨。二、骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)病人及對照的BMSC的培養(yǎng)方法及鑒定參見文獻(xiàn)1。三、正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cell, BMMC)的原代培養(yǎng)用淋巴細(xì)胞分離液分離出正常BMMC，以2106mL接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)體系及條件同BMSC，培養(yǎng)的細(xì)胞在7 d內(nèi)備用，此時(shí)懸浮細(xì)胞主要是造血細(xì)胞。四、Raji細(xì)胞Raji細(xì)胞是淋巴瘤細(xì)胞，作為本

9、實(shí)驗(yàn)中的腫瘤細(xì)胞，由本校腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室孫韻老師惠贈(zèng)。在含20%小牛血清的1640中培養(yǎng)，每23 d換液1次。五、骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附率的測定參考文獻(xiàn)2，略加修改。將培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1105mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 L，37，5% CO2孵育過夜。待基質(zhì)細(xì)胞成層后，加入正常BMMC或Raji細(xì)胞，濃度依實(shí)驗(yàn)而定，每孔100 L，繼續(xù)孵育，孵育時(shí)間依實(shí)驗(yàn)而定。用PBS輕輕洗去未粘附的細(xì)胞，加入MTT(5 g/L)，每孔20 L，再培養(yǎng)4 h。吸取培養(yǎng)上清，加入DMSO，每孔200 L，使甲月替顆粒溶解。在酶標(biāo)儀上測定OD值

10、，波長570 nm，參考波長630 nm。骨髓基質(zhì)細(xì)胞對照組只加入骨髓基質(zhì)細(xì)胞，不加其他細(xì)胞，而以培養(yǎng)基代替，測OD值。在向骨髓基質(zhì)細(xì)胞層上加入正常BMMC或Raji細(xì)胞的同時(shí)，取等量細(xì)胞同條件另行懸浮培養(yǎng)，加入MTT培養(yǎng)4 h后，離心去上清，再加入DMSO測定細(xì)胞的總OD值。計(jì)算公式：粘附率(%)=(所測得OD值-骨髓基質(zhì)細(xì)胞OD值)/(所加入細(xì)胞的總OD值)每實(shí)驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3孔。六、骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面粘附分子的測定將培養(yǎng)的BMSC用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，每份標(biāo)本編3支試管，一管加入20 L對照試劑(鼠IgG1-PE)和兔抗鼠IgG-FITC 5L另兩管分別加入CD106

11、2L、CD54-PE2 L，每管各加入細(xì)胞懸液100 L(細(xì)胞5105)，室溫(1825)中孵育30 min，然后用PBS洗兩次，CD106管再加入兔抗鼠IgG-FITC 5L孵育30 min后PBS洗兩次，最后各管加入300 L PBS用流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司生產(chǎn))檢測。將激光管預(yù)熱30 min后用熒光微球調(diào)整儀器，使各放大器接收信號的HCV值2%，以對照管作為空白定標(biāo)，計(jì)算10 000個(gè)細(xì)胞，記錄標(biāo)本的陽性細(xì)胞百分率。七、ICAM-1和VCAM-1單克隆抗體對骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附抑制率的測定將培養(yǎng)的BMSC用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1105mL，

12、接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 L,37，5% CO2孵育過夜。待基質(zhì)細(xì)胞成層后，分別加入ICAM-1和VCAM-1單克隆抗體(購于美國Pharmingen公司)，10 g/mL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后用PBS洗去未與BMSC結(jié)合的抗體。實(shí)驗(yàn)分四組：對照組：不加粘附分子單克隆抗體；ICAM-1組：加入ICAM-1單克隆抗體；VCAM-1組：加入VCAM-1單克隆抗體；ICAM-1和VCAM-1組；同時(shí)加入ICAM-1和VCAM-1單克隆抗體。然后分別加入正常BMMC或Raji細(xì)胞，以下步驟與BMSC粘附率的測定相同。BMSC粘附抑制率的計(jì)算：八、統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用t檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用

13、s表示。結(jié)果一、ALL骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長對照組的BMSC于接種后1周左右開始形成集落，4周左右形成基質(zhì)細(xì)胞層。而部分ALL患兒尤其是急性期組患兒BMSC生長緩慢，形成集落的時(shí)間可延長至12周，成層的時(shí)間也可延遲至45周，且形成的集落小，提示ALL患兒BMSC增殖能力差，也可能和ALL急性期骨髓單核細(xì)胞中白血病細(xì)胞比例增加而間質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量相對減少有關(guān)。二、ALL骨髓基質(zhì)細(xì)胞對骨髓造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞粘附行為的變化(一)達(dá)到最大粘附率的時(shí)間提前BMSC對BMMC和Raji細(xì)胞的粘附率和粘附的時(shí)間有關(guān)，隨著粘附時(shí)間的延長，粘附率逐步增高達(dá)高峰。對照組BMSC對正常BMMC和腫瘤細(xì)胞粘附達(dá)高峰的時(shí)間為6

14、 h，而急性期和長期緩解期的ALL患兒可提前至2 h，即使再延長粘附時(shí)間也不能增加粘附率。見1和2。 Fig 1 The relationship between the adhesion of BMSC to normal BMMC and adhesion time1BMSC對正常BMMC的粘附與粘附時(shí)間的關(guān)系 Fig 2 The relationship between the adhesion of BMSC to Raji cells and adhesion time2BMSC對Raji細(xì)胞的粘附與粘附時(shí)間的關(guān)系(二)對正常骨髓造血細(xì)胞粘附的飽和濃度降低，對Raji細(xì)胞粘附的飽和濃

15、度增高BMSC對BMMC和Raji細(xì)胞的粘附率和BMMC及Raji細(xì)胞的濃度有關(guān)，隨著BMMC和Raji細(xì)胞的濃度增高而增高至飽和。對照組BMSC粘附正常BMMC的飽和濃度可達(dá)2.5106/mL，部分急性期ALL患兒的飽和濃度可降至1.25106mL，長期緩解期患兒的飽和濃度也可達(dá)2.5106/mL，見3。對照組BMSC粘附Raji細(xì)胞的飽和濃度為2.5106/mL，而急性期和長期緩解期的ALL患兒飽和濃度可高達(dá)5.0106mL，見4。 Fig 3 Adhesion of BMSC to different concentration of normal BMMC3BMSC對不同濃度正常BMM

16、C的粘附 Fig 4 Adhesion of BMSC to different concentration of Raji cell 4BMSC對不同濃度的Raji的粘附(三)對正常骨髓造血細(xì)胞的最大粘附率下降，對腫瘤細(xì)胞的最大粘附率增高根據(jù)結(jié)果(一)和(二)我們知道BMSC對BMMC和Raji細(xì)胞的粘附與粘附時(shí)間、BMMC和Raji細(xì)胞的濃度以及ALL的不同治療階段有關(guān)，因此我們對不同病期病人選擇粘附高峰時(shí)間及正常BMMC、Raji細(xì)胞的飽和濃度進(jìn)行BMSC粘附率的檢測以盡可能反映BMSC的最大粘附率。在BMSC對正常BMMC的粘附中，正常BMMC的濃度為2.5106mL，對照組粘附時(shí)間取

17、6 h，ALL病人粘附時(shí)間取2 h。在BMSC對Raji細(xì)胞的粘附中，Raji細(xì)胞的濃度對照組為2.5106mL, ALL病人為5.0106mL，粘附時(shí)間對照組為6 h，ALL病人為2 h。結(jié)果ALL急性期組對正常骨髓造血細(xì)胞的粘附率明顯低于對照組，而緩解組及長期緩解組對正常骨髓造血細(xì)胞的粘附率已逐漸恢復(fù)至正常水平，長期緩解組對正常BMMC的粘附率明顯高于急性期組。ALL急性期組對Raji細(xì)胞的粘附率略高于對照組，長期緩解組對Raji細(xì)胞的粘附率明顯高于對照組，見表1。表1 BMSC對正常BMMC和Raji細(xì)胞的粘附率Tab 1 Adhesion of BMSC to normal BMMC

18、and Raji cells(%,s)GroupnAdhesion tonormal BMMCAdhesion to RajiControl1336.798.6348.0114.87Acute phase ALL726.0211.55*57.9820.11Remissive ALL734.2220.5156.5711.27Long term remissive ALL642.4112.8267.2419.80* *P0.05, vs control; P0.05, vs acute phase ALL以上結(jié)果提示ALL患兒BMSC粘附行為發(fā)生了變化，不同治療階段變化不同。在急性期對正常骨髓造血

19、細(xì)胞的粘附能力下降，在緩解期對腫瘤細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)。三、ALL BMSC表面粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)(一)ALL急性期組和緩解組BMSC表面ICAM-1的表達(dá)明顯低于對照組，而長期緩解組BMSC表面的ICAM-1表達(dá)和對照組相比無明顯差別，但明顯高于急性期組，見表2。 表2 BMSC表面ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)Tab 2 Expression of ICAM-1 and VCAM-1 onBMSC(%,s)GroupnICAM-1VCAM-1Control1778.3819.7314.5014.37Acute phase ALL726.0317.23*13.1814.

20、02Remissive ALL741.826.99*16.2212.81Long term remissive ALL659.1822.6424.7019.92 *P0.01, vs control; P0.05, vs acute phase ALL (二)ALL各組BMSC表面的VCAM-1表達(dá)與對照組相比無明顯差別，見表2。四、ICAM-1和VCAM-1單克隆抗體對骨髓細(xì)胞粘附的阻斷ICAM-1單抗和VCAM-1單抗可以部分阻斷對照組及ALL患兒的BMSC對骨髓單個(gè)核細(xì)胞的粘附，但不能阻斷BMSC對Raji細(xì)胞的粘附，見表3。表3ICAM-1和VCAM-1單克隆抗體對BMSC粘附的抑制T

21、ab 3 Inhibition of ICAM-1 and VCAM-1 monoclonalantibodies to adhesion of BMSC(%，s)GroupAdhesion to BMMAdhesion to Raji cellsControl41.516.9548.043.34CD5420.184.7949.687.71CD10624.447.4552.568.06CD54+CD10621.904.7748.844.55 結(jié)果(三)和(四)表明ALL患兒BMSC表面的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)也有所改變，并與疾病的發(fā)展階段有關(guān)，且ICAM-1和VCAM-1均參與BMSC

22、對骨髓造血細(xì)胞的粘附。 討論BMSC對造血細(xì)胞的自我更新、定向分化、增殖有重要的作用。對白血病病人的BMSC研究的結(jié)果表明：白血病的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外生長緩慢，形成的集落的能力較差3；對骨髓造血細(xì)胞的支持能力降低4；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BMSC分泌細(xì)胞因子異常5；粘附功能也有所變化：王江方等檢測了3例ALL患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞株的粘附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)比正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞明顯增高2。在本研究中ALL患兒的BMSC的粘附行為明顯異常，在急性期表面對正常骨髓造血細(xì)胞的粘附下降，與疾病的不同發(fā)展階段有關(guān)。在急性期主要表現(xiàn)在對正常骨髓造血細(xì)胞的粘附能力下降，在緩解期主要是對腫瘤細(xì)胞的粘附能力增加。這種粘附行為異

23、常的原因可能是ALL BMSC表面的粘附分子等功能蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變，而粘附行為異常的結(jié)果則導(dǎo)致BMSC與骨髓中的正常和異常的造血細(xì)胞的相互作用異常，因此ALL時(shí)BMSC的粘附功能也發(fā)生了明顯的變化，并可能參與了疾病的發(fā)展過程。BMSC一方面通過與造血細(xì)胞直接接觸，對造血細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)；另一方面通過分泌多種細(xì)胞因子如GSF、IL-3、IL-6等對造血細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。在ALL的治療過程中，尤其是在疾病的急性期，臨床上常常出現(xiàn)嚴(yán)重的骨髓抑制，是白血病死亡的常見原因之一，一般認(rèn)為是由于白血病惡性克隆及化療藥物對骨髓造血細(xì)胞的抑制所致。但在我們的研究中發(fā)現(xiàn)：在ALL急性期，BMSC對骨髓造血細(xì)胞的粘附率

24、明顯下降，隨著病情的緩解，粘附率逐漸上升，直至恢復(fù)正常，提示ALL時(shí)BMSC粘附功能的損害可能使其對骨髓造血細(xì)胞的接觸調(diào)節(jié)障礙，對造血細(xì)胞的支持作用減少，成為骨髓造血抑制的原因之一。粘附分子是介導(dǎo)BMSC與造血細(xì)胞直接接觸的因素之一，通過粘附分子可以傳遞某些信息以實(shí)現(xiàn)BMSC和造血細(xì)胞的相互作用。在BMSC表面表達(dá)的多種粘附分子包括ICAM-1和VCAM-1，ICAM-1可以和造血細(xì)胞上的LFA-1、Mac-1相結(jié)合，VCAM-1可以和造血細(xì)胞上的VLA-4相結(jié)合。我們檢測了ALL病兒的BMSC表面的粘附分子表達(dá)，結(jié)果表明急性期組病人BMSC表達(dá)ICAM-1明顯降低，與王江方等的研究結(jié)果一致，

25、在病情緩解后ICAM-1逐漸升高至正常，但I(xiàn)CAM-1的恢復(fù)較BMSC對BMMC粘附率的恢復(fù)要慢，因?yàn)榫徑饨M的粘附率已正常，而ICAM-1的水平仍明顯低于對照組。VCAM-1變化不是很明確。用ICAM-1和VCAM-1單克隆抗體可以部分阻斷BMSC對骨髓造血細(xì)胞的粘附，說明ICAM-1和VCAM-1參與了BMSC對骨髓造血細(xì)胞的粘附，BMSC表面粘附分子的變化可導(dǎo)致ALL BMSC粘附行為的變化。在白血病的治療過程中，影響患者長期無病生存的另一個(gè)重要原因是白血病的復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為白血病復(fù)發(fā)的根源是微小殘留白血病的形成，微小殘余白血病的發(fā)病機(jī)制到目前為止還不清楚。BMSC與白血病細(xì)胞直接接觸后對白

26、血病細(xì)胞有一定的支持作用6，甚至可以使白血病細(xì)胞的抗藥性增強(qiáng)7，還可以減少白血病細(xì)胞的凋亡8。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ALL BMSC對腫瘤細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)，尤其在長期緩解的病人。因此我們推測BMSC可能通過對白血病細(xì)胞的粘附增強(qiáng)而發(fā)揮上述的支持作用，并有可能保護(hù)和隱藏白血病細(xì)胞使其不容易被機(jī)體的免疫功能和化療藥物殺滅，從而參與了微小殘余白血病的形成。在本實(shí)驗(yàn)中長期緩解病人BMSC對腫瘤細(xì)胞的粘附率增高與ICAM-1和VCAM-1關(guān)系不密切，因?yàn)橛肐CAM-1和VCAM-1單抗不能阻斷BMSC對腫瘤細(xì)胞的粘附，提示除了ICAM-1和VCAM-1外，還有其他粘附分子參與了細(xì)胞之間的直接接觸，還需進(jìn)

27、一步研究。黃耘（中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科， 廣東 廣州 510080）李樹濃（中山醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室， 廣東 廣州 510089）李曉瑜（中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科， 廣東 廣州 510080）林穗珍（中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科， 廣東 廣州 510080）羅學(xué)群（中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科， 廣東 廣州 510080）覃肇源（中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科， 廣東 廣州 510080）參考文獻(xiàn)1楊天木盈. 造血細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)M. 西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1985. 147160.2王江方，張學(xué)光，張毅，等. 急性淋巴細(xì)胞性白血病及其骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附分子表達(dá)和粘附行為的探討J. 中國免疫學(xué)雜志，1996，12：290293.3Lisovsky MYa, Savchenko VG. Defect of stromal microenvironment in long term bone marrow cultures of patients with acute and chronic myelogenous leukemiaJ. Leuk Lymphoma, 1995, 19: 145152.4Sparrow RL, OFlaberty E, Blanksby M, et al. Per