原發(fā)性肝癌組織雙向電泳技術(shù)優(yōu)化

1、原發(fā)性肝癌組織雙向電泳技術(shù)優(yōu)化         11-03-31 16:22:00     作者：邱芳華 聶靜 沈順利    編輯：studa20【摘要】  【目的】 優(yōu)化雙向凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)步驟，總結(jié)出一套適用于原發(fā)性肝癌組織的雙向凝膠電泳技術(shù)?！痉椒ā?對(duì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：樣本處理、上樣方法、聚焦條件等進(jìn)行研究與優(yōu)化，考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行凝膠圖像比較。 【結(jié)果】 采用7 mmol /L尿素、2 mol /L硫脲、40

2、 g/L CHAPS、100 mmol /L DTT、5 g/L (pH 3-10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF作為裂解液，丙酮沉淀蛋白，主動(dòng)水化上樣法，聚焦電壓達(dá)到140 kV可以得到分辨率高、重復(fù)性好的結(jié)果。 【結(jié)論】 上述改良提高了2-D圖譜中蛋白位點(diǎn)的分辨率和重復(fù)性，為原發(fā)性肝癌組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  原發(fā)性肝癌; 蛋白質(zhì)組學(xué); 雙向電泳Abstract： 【Objective】 To establish a set of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2

3、-DE) techniques for proteomic research of hepatocellular carcinoma (HCC) tissues. 【Methods】 Different methods or condition for key procedures of 2-DE were adjusted and optimized， including sample preparation， sample loading methods， iso-electronic focusing (IEF)， comparing with the gel after Commass

4、ie blue staining. 【Results】 High-resolution results with repetitiveness could be obtained according to the condition： 7 mmol/L urea， 2 mmol/L thisurea， 4%CHAPS， 100 mmol/L DTT， 0.5% (pH 3-10) IPG buffer， 1 mmol/L PMSF as lysis buffer， actone precipitate protein， initiative rehydration method and IEF

5、 to 140 kV. 【Conclusion】 The optimized method provided 2-D results with high resolution and repetitiveness， which pave the way for the proteomic research for HCC tissues.原發(fā)性肝癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中位居第二1。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究腫瘤發(fā)生機(jī)制2，尋找腫瘤標(biāo)志物的重要工具，對(duì)于肝癌發(fā)生機(jī)制和治療作用靶點(diǎn)的研究具有重要意義3。我國(guó)早在2003年就啟動(dòng)了人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HUPO)，并

6、取得了一定的研究成果。但關(guān)于肝癌組織雙向電泳的技術(shù)卻少完整系統(tǒng)的報(bào)道，為了建立高分辨率可重復(fù)的肝癌組織雙向凝膠電泳技術(shù)，我們對(duì)人肝癌組織的雙向電泳技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究對(duì)比，優(yōu)選出一套適合肝癌組織的雙向凝膠電泳方法，供從事肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳的技術(shù)人員參考。1 材料與方法1.1 材 料1.1.1 標(biāo)本采集原發(fā)性肝癌組織來(lái)自我院肝癌切除術(shù)患者。組織離體后立即以預(yù)冷PBS沖洗，在冰上分裝置入凍存管，液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入-80 冰箱中保存?zhèn)溆?。所有病例均?jīng)術(shù)后病理證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。1.1.2 試 劑丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、過(guò)硫酸胺、四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)

7、、尿素、十二烷基硫酸鈉(SDS)、3-3-(膽酰氨基丙基)二甲氨基丙磺酸鹽(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、甘氨酸、IPG緩沖液(pH 3 10)、蛋白酶抑制劑、碘乙酰氨(IAA)、硫脲、18 cm 膠條(pH 3 10 NL)均為Amersham公司產(chǎn)品。TCA、丙酮為Sigma公司產(chǎn)品。無(wú)水乙醇為國(guó)產(chǎn)分析純(廣州化學(xué)試劑廠)，所有溶液均用去離子水配制。1.1.2 主要設(shè)備Immobiline Dry Strip，Ettan IPG 3等電聚焦電泳儀，Ettan DALT six 600 垂直電泳槽，Imagescanner高密度掃描儀，ImageMaster軟件均購(gòu)自Amersham公

8、司。1.2 方 法1.2.1 蛋白質(zhì)樣品制備粗樣本制備：取肝癌組織100 mg，液氮冷凍研磨，加入0.5 mL裂解液(含10 g/L PMSF蛋白酶抑制劑)，裂解液(7 mmol/L尿素、2 mol/L硫脲、40 g/L CHAPS、100 mmol/L DTT、50 g/L(pH 3 10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF)，超聲裂解，15 ，離心10 min，取上清液，4 ，超速離心50 min，避開(kāi)漂浮的脂質(zhì)層，吸取離心上清4 ，再次離心50 min;取上清。Bradford法定量，分裝后置-80 保存。為充分去除樣本中含有的雜質(zhì)對(duì)等電聚焦的影響，我們采用了常用的三種

9、蛋白沉淀方法，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。丙酮沉淀蛋白：加入4倍體積的冰丙酮使蛋白在-20 沉淀至少2 h，4 ，離心15 min，用裂解液重溶。 三氯乙酸/丙酮沉淀：將三氯乙酸加到提取組織液中，終質(zhì)量濃度為100 g/L，再加入4倍體積的冰丙酮使蛋白在-20 沉淀至少2 h， 4 離心15 min，最后再用冰丙酮清洗沉淀 ，去除三氯乙酸，用裂解液重溶。Cleaning-up試劑盒沉淀蛋白：按Amersham公司的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用裂解液重溶。1.2.2 等電聚焦電泳分別采取目前常用兩種上樣方法：標(biāo)準(zhǔn)膠條槽上樣(主動(dòng)水化)及杯上樣(被動(dòng)水化)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。聚焦程序參考聚焦系統(tǒng)操作指南，同時(shí)利

10、用軟件對(duì)聚焦電壓，電流進(jìn)行檢測(cè)，指導(dǎo)聚焦程序的調(diào)整，對(duì)不同聚焦方法進(jìn)行比較分析(表1)。1.2.3 第二向 SDS 電泳(SDS-PAGE) 等電聚焦后的膠條分別以SDS平衡緩沖液(第一次加入100 mg/10 mL DTT，第二次加入250 mg/10 mL 碘乙酰胺)平衡兩次，每次15 min。平衡后IPG膠條轉(zhuǎn)移至電泳系統(tǒng)，用125 g/L的膠進(jìn)行二向電泳，每塊膠2 W，電泳50 min后改為每塊膠15 W，電泳至溴酚藍(lán)跑到凝膠底部。凝膠進(jìn)行熱考馬斯亮蘭染色。1.2.4 凝膠圖像采集與分析染色后凝膠以Image scanner高密度掃描儀獲取圖像，利用ImageMaster軟件對(duì)圖像進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)自動(dòng)檢測(cè)，然后手工刪除假點(diǎn)，添加未檢出的斑點(diǎn)，最后進(jìn)行斑點(diǎn)匹配，分析。2 結(jié) 果2.1 蛋白沉淀方法對(duì)電泳結(jié)果的影響從圖1可見(jiàn)，未經(jīng)處理的樣本蛋白點(diǎn)雖然很多(1 920點(diǎn))，但分辨率很差。丙酮，TCA-丙酮，Cleaning-up