口腔鱗癌細(xì)胞系中Podoplanin通過EGF-Src-Cas通路促進(jìn)細(xì)胞遷移

1、口腔鱗癌細(xì)胞系中Podoplanin通過EGF-Src-Cas通路促進(jìn)細(xì)胞遷移摘要人類podoplanin是一種類似于唾粘蛋白的1型跨膜糖蛋白，它與細(xì)胞遷移、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們最近的口腔鱗癌（OSCC）研究證實(shí)podoplanin免疫組化表達(dá)的程度與上皮發(fā)育不良相關(guān)并且與不良的病理分化級(jí)別有密切關(guān)系。此外，據(jù)報(bào)道Src與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）有直接聯(lián)系，在OSCC細(xì)胞中被表皮生長(zhǎng)因子（EGF）激活然后磷酸化Crk相關(guān)底物(Cas，podoplanin作用于Src和Cas的下游來促進(jìn)細(xì)胞遷移。然而，podoplanin的分子功能尚不明確。在本次研究中我們?cè)贠SCC細(xì)胞系中通過實(shí)時(shí)

2、RT-PCR，Western blotting和scratch assay來闡明與podoplanin表達(dá)相關(guān)的各種生長(zhǎng)因子包括EGF和Src-Cas信號(hào)通路的分子生物學(xué)功能。podoplanin被發(fā)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞遷移和口腔中間質(zhì)非金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)有顯著的影響在被EGF激活后。podoplanin促進(jìn)口腔癌細(xì)胞遷移，EGF-Src-Cas通路是一種口腔癌進(jìn)程中的可能機(jī)制。關(guān)鍵詞:OSCC;podoplanin;EGF;MMPs;EGF-Src-Cas通路介紹人類podoplanin是一種類似于唾粘蛋白的1型跨膜糖蛋白，由162個(gè)氨基酸組成。這種蛋白最初在大鼠足細(xì)胞的表面被檢測(cè)出來

3、，是一種38kDa的粘蛋白，這些大鼠被嘌呤霉素誘導(dǎo)腎病，這種蛋白與扁平足有關(guān)。podoplanin在細(xì)胞收縮和細(xì)胞骨架再造中具有一定作用。幾個(gè)研究表明podoplanin的過表達(dá)與OSCC不良預(yù)后有關(guān)。我們以前的研究也表明podoplanin強(qiáng)烈的免疫組化表達(dá)與上皮發(fā)育不良和不良的病理分化級(jí)別有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明podoplanin與腫瘤發(fā)展（發(fā)育不良-癌）有關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）一種發(fā)展調(diào)節(jié)程序，具有顯著的涉及轉(zhuǎn)移上皮細(xì)胞向遠(yuǎn)處傳播的能力和獲得侵襲力及抵抗細(xì)胞凋亡的能力。兩個(gè)以前的關(guān)于EMT和podoplanin表達(dá)的聯(lián)系研究已有對(duì)比發(fā)現(xiàn)。一個(gè)研究指出：podoplanin在腫瘤侵襲中具有

4、作用，通過結(jié)合蛋白例如：埃茲蛋白，根蛋白和膜突蛋白來激活RhoA一種細(xì)胞因子，借此重建腫瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架并促成他們能動(dòng)性的增強(qiáng)。另一研究指出：podoplanin轉(zhuǎn)換了侵襲模式，從涉及EMT的單細(xì)胞轉(zhuǎn)換成缺少EMT的大細(xì)胞群。在我們以前的研究中發(fā)現(xiàn)：62%podoplanin陽性的具有病理轉(zhuǎn)移的原發(fā)OSCC中都存在EMT，而其余無EMT。這些發(fā)現(xiàn)表明腫瘤細(xì)胞中podoplanin表達(dá)不干擾EMT的發(fā)生。Src屬于無感受器的酪氨酸激酶家族，叫做Src族激酶（SFKs）。SFKs在許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中有決定性的作用，它調(diào)節(jié)不同的進(jìn)程包括細(xì)胞分裂，能動(dòng)性，粘附血管發(fā)生和存活。SFKs在許多細(xì)

5、胞類型中有誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)變的能力，并在不同種類的上皮和非上皮惡性存在頻繁的過表達(dá)，它活性程度的增加常與惡性潛力有關(guān)。Src充當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的角色，從細(xì)胞表面受體到在底物上酪氨酸殘基連續(xù)的磷酸化。通過結(jié)合活化劑分子諸如：受體激酶接合器包括EGF,血小板來源的生長(zhǎng)因子（PDGF），基本纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）,或是有活性的受體本身，或是酪氨酸C端被某一酪氨酸磷酸酯酶去磷酸化，來轉(zhuǎn)化SFKs為一種機(jī)能上有活力的形式，最后磷酸化下游的效應(yīng)器并導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)答。p130Cas是一種130kDa的支架蛋白，它是被補(bǔ)充為粘著斑后結(jié)扎成的整聯(lián)蛋白。它的命名是因?yàn)槁?lián)合并被Crk相關(guān)底物磷酸化。

6、p130Cas包含一個(gè)SH3域，它通過干擾粘著斑激酶（FAK）來調(diào)節(jié)粘著斑的局限化。p130Cas中脯氨酸豐富結(jié)點(diǎn)區(qū)域位于底物結(jié)合域和C端之間，間接干擾SFKs。另外，在CHO細(xì)胞中，p130Cas作用于FAK的下游來促進(jìn)細(xì)胞遷移，在人胰腺癌細(xì)胞中作用于p130Cas和Crk之間來激活Rac，它是細(xì)胞遷移所必須的。因此，F(xiàn)AK/p130Cas相互作用被考慮為細(xì)胞遷移的“分子開關(guān)”。關(guān)于聯(lián)合Src-Cas信號(hào)通路和podoplanin表達(dá)，Yongquan等人提出：podoplanin作用于Src和Cas的下游，并且Src利用Cas來誘導(dǎo)podoplanin表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移并導(dǎo)致癌侵襲

7、和轉(zhuǎn)移。目前研究的目標(biāo)是闡明podoplanin在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的分子生物學(xué)作用，通過在OSCC細(xì)胞系中刺激癌微環(huán)境生長(zhǎng)因子如：bFGF，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1（TGF-1），HGF，PDGF和EGF，并檢測(cè)Src-Cas信號(hào)通路。材料和方法 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)人類口腔鱗癌細(xì)胞衍生細(xì)胞系：Ca9-22，HSC-2，HSC-3和HSC-4。每一細(xì)胞系在RPMI1640培養(yǎng)基中常規(guī)生長(zhǎng)，添加100 U/mL青霉素-鏈霉素，10 U/mL兩性霉素B和10%胎兒牛組血清，在潮濕環(huán)境中5% CO2，37°C。實(shí)時(shí)定量RT-PCR所有的RNAs利用哺乳類動(dòng)物細(xì)胞蛋白和RNA提取器提取，在提取前在每

8、一細(xì)胞系中加100ng/mLbFGF,TGF-b1,HGF,PDGF,和EGF過24小時(shí)和48小時(shí)。實(shí)時(shí)RT-PCR通過熱循環(huán)實(shí)時(shí)系統(tǒng)完成。one-step SYBR primeScript RT-PCR Kit II用于反應(yīng)。引物，源于podoplanin，MMP-2，MMP-2，MMP-2和甘油醛3脫氫酶（GAPDH）的序列，作為內(nèi)部統(tǒng)一化控制，見表1。每一PCR混合物（最終反應(yīng)容積20 L）包含10.0L One Step SYBR RT-PCR緩沖劑4，0.8L PrimeScript 1step Enzyme Mix 2,0.8L正向引物，0.8L反向引物，7.6LRNA和無菌水。P

9、CR條件：42°C / 5 min; 95°C / 10 s; 45 cycles of 95°C / 5 s,60°C / 30 s。按照解鏈程序完成分離。每個(gè)樣本的RQ值根據(jù)雙份測(cè)定并于GAPDH的平均值比較。siRNA轉(zhuǎn)染siRNAs for podoplanin，c-Src siRNA和p130Cas與FuGENE轉(zhuǎn)染劑以1:1稀釋，并混合于RPMI1640培養(yǎng)基中。苯丙醇2（PP2），一種Src的抑制劑這種化合物的原液來與二甲亞酚（DMSO）,儲(chǔ)存與-80°C。蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）細(xì)胞蛋白用PAREx提取，

10、在提取前在每一細(xì)胞系中加100ng/mLbFGF,TGF-b1,HGF,PDGF,和EGF過24小時(shí)和48小時(shí)。抑制配位測(cè)定，在podoplanin siRNA，c-src siRNA和p130Cas siRNA混合物中加入PP2-DMSO溶液，之前加入100 ng/mL EGF過24小時(shí)和48小時(shí)。細(xì)胞溶解物被離心（at 12,000 rpm for 5 min at 4°C），上浮物被恢復(fù)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。等分的蛋白置于10%十二烷硫酸鈉聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）,然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用1%牛血清白蛋白（BSA）固定。膜中的特異蛋白被檢測(cè)到，通過特異主要抗體一夜4

11、ºC的潛伏期，之前加入特異二抗如抗鼠或抗兔結(jié)合過氧化物酶和(DAB/H2O2溶液過5-10分鐘。主要抗體見表2。細(xì)胞遷移分析（scratch assay）細(xì)胞系被播種于12-well的組織培養(yǎng)載玻片中（at 5 × 105 cells/well and 培養(yǎng)環(huán)境 37°C for 24 h）。一微升混合液（siRNA for podoplanin終濃度 10 nM）用于每一well中并培養(yǎng)24小時(shí)。在板的中心用吸管輕輕使一個(gè)scratch通過，細(xì)胞然后和EGF一起培養(yǎng)。細(xì)胞移動(dòng)通過scratch被觀察，移動(dòng)距離被測(cè)量在0小時(shí)和27小時(shí)。結(jié)果bFGF,TGF-1,H

12、GF,PDGF和EGF對(duì)podoplanin的表達(dá)的影響：為了調(diào)查哪種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)podoplanin表達(dá)，我們選用bFGF,TGF-1,HGF,PDGF和EGF加入Ca9-22，HSC-2，HSC-3和HSC-4細(xì)胞系中。在所有OSCC細(xì)胞系中除了HSC-3細(xì)胞系，EGF和TGF-1都增強(qiáng)了podoplanin mRNA和蛋白的表達(dá)（圖1A,B）。在HSC-3細(xì)胞系中，任何生長(zhǎng)因子都未發(fā)現(xiàn)對(duì)podoplanin表達(dá)有顯著影響。EGF預(yù)處理48小時(shí)后的所有細(xì)胞系都增強(qiáng)了podoplanin表達(dá)，除了HSC-3細(xì)胞系（圖2A,B）。EGF對(duì)口腔癌細(xì)胞遷移的影響通過podoplanin和podop

13、lanin特異siRNA誘導(dǎo)：我們利用podoplanin特異siRNA分析功能缺失。Bars表示細(xì)胞在0小時(shí)和27小時(shí)相對(duì)距離的移動(dòng)。每一Bar代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的mean±SD。在HSC-2，HSC-3和HSC-4細(xì)胞系中podoplanin特異siRNA抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移（圖3A,B），其中的podoplanin蛋白表達(dá)也被抑制（圖3C）。EGF對(duì)MMPs mRNA的表達(dá)的影響：EGF預(yù)處理后在Ca9-22和HSC-2細(xì)胞系中增強(qiáng)了MMP-9 mRNA的表達(dá)，但沒有改變MMP-2和MMP-7 mRNA的表達(dá)，甚至在HSC-2，HSC-3和HSC-4細(xì)胞系中還減少了（圖4）。EGF和Sr

14、c特異siRNA預(yù)處理后的OSCC細(xì)胞系中Src活力及它對(duì)podoplanin表達(dá)的影響：為了調(diào)查Src誘導(dǎo)podoplanin表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞遷移，我們進(jìn)一步調(diào)查了在OSCC細(xì)胞系中Src和podoplanin的聯(lián)合表達(dá)。在OSCC細(xì)胞系中Src表達(dá)無處不在，并在EGF刺激下增強(qiáng)（圖5A）。Western blotting分析也顯示了Src被去磷酸化的Y527激活。Src特異siRNA抑制podoplanin表達(dá)尤其在Ca9-22和HSC-2細(xì)胞系中（圖5B）。EGF和p130Cas特異siRNA預(yù)處理后的OSCC細(xì)胞系中p130Cas活力及它對(duì)podoplanin表達(dá)的影響：在OSCC中調(diào)查

15、Src和podoplanin下游的p130Cas。在OSCC細(xì)胞系中p130Cas表達(dá)無處不在，并在EGF刺激下增強(qiáng)（圖6A）。p130Cas特異siRNA抑制podoplanin mRNA和蛋白的表達(dá)，尤其是在HSC-2細(xì)胞系中（圖6B,C）。PP2對(duì)podoplanin表達(dá)的影響：PP2是一種Src抑制劑，不影響Src本身的表達(dá)。在所有OSCC細(xì)胞系中podoplanin表達(dá)以劑量依賴方式被抑制（圖7）。討論在生長(zhǎng)因子關(guān)于受體酪氨酸激酶中，很少有研究聯(lián)合HGF或PDGF和OSCC，來與EGF比較。HGF的主要作用是在頭頸部SCC（HNSCC）中作為旁分泌因子，HGF/c-Met通路頻繁上調(diào)

16、并在HNSCC中起作用。在HNSCC中c-Src和c-Met的相互作用有所不同。HGF促進(jìn)有絲分裂并且是人類HNSCC細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)因子。HNSCC細(xì)胞潛伏期HGF的存在可導(dǎo)致FAK和生長(zhǎng)促進(jìn)激酶Erk的磷酸化快速增長(zhǎng)。ERK MAPKs是一種絲裂原激活蛋白激酶，位于EGF,NGF和PDGF下游。然而，我們目前的研究證明在生長(zhǎng)因子關(guān)于SFK受體中，只有EGF顯著提高podoplanin表達(dá)，尤其是在48小時(shí)后。而且，值得注意的是TGF-1，它不是SFKs的一種，它是誘導(dǎo)EMT最廣泛調(diào)查的細(xì)胞因子的一種，在它的表達(dá)中有顯示了增長(zhǎng)。這一發(fā)現(xiàn)表明：在OSCC中可能存在通過TGF-1的podoplani

17、n依賴信號(hào)通路。最近的研究以表明在角蛋白細(xì)胞中TGF-1和STAT-3誘導(dǎo)podoplanin表達(dá)，這可能與傷口愈合的進(jìn)程有關(guān)。在OSCC中scratch assay和MMP mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明了明顯的podoplanin依賴細(xì)胞遷移。MMPs由腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞分泌而來，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，通過降解腫瘤周圍的細(xì)胞外間質(zhì)（ECM），尤其是基底膜。新出現(xiàn)的證據(jù)表明：MMPs能刺激EMT進(jìn)程來增加腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移潛力。大多數(shù)報(bào)道表明：MMP-2,-3和-9蛋白突出表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。MMP-9是IV型膠原酶，豐富存在于在基底膜中，并且癌的轉(zhuǎn)移潛能可能與酶的降解級(jí)別有關(guān)。在目前的研究中MMP

18、-9的表達(dá)在被EGF處理的Ca9-22和HSC-2細(xì)胞系中有所增強(qiáng)，這與以前HNSCC的研究一致，表明隨著鈣黏著蛋白降解，進(jìn)而MMP-9產(chǎn)生，激活EGFR從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。雖然新證據(jù)表明SFKs可能調(diào)停MMP活性，但更多研究闡明在OSCC細(xì)胞系中Src和MMP活性的關(guān)聯(lián)是需要的。podoplanin可能促進(jìn)腫瘤侵襲，通過它本身具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重建的能力，來促成他們能動(dòng)性的增強(qiáng)。podoplanin和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聯(lián)合似乎被埃茲蛋白介導(dǎo)，它在podoplanin過表達(dá)出現(xiàn)中被顯著磷酸化。我們的一系列研究關(guān)于EGF-Src-Cas-podoplanin信號(hào)通路已經(jīng)揭示了口腔癌細(xì)胞中Src和p130Cas的表