水稻土中鐵還原菌的分離純化及鐵還原能力分析

1、第36卷第10期西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版Vol.36No.10 2008年10月Journal of Northwest A&F University(Nat.Sci.Ed.Oct.2008水稻土中鐵還原菌的分離純化及鐵還原能力分析王偉民,曲東,徐佳(西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊凌712100摘要【目的】對水稻土中鐵還原菌進(jìn)行分離純化,比較不同培養(yǎng)基的分離效果,研究不同菌株的鐵還原特征?！痉椒ā恳运拇ê徒魉就翞椴牧?采用P T YG固體平板培養(yǎng)基及檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基(斜面分離出兼性厭氧和嚴(yán)格厭氧的菌株,并通過檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基及Fe(O H3培養(yǎng)基進(jìn)行鐵還原能力測定

2、,比較不同菌株的Fe(還原率大小、鐵還原特征曲線,以及分別在LB液體培養(yǎng)基和檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中的生長曲線。【結(jié)果】在以葡萄糖為碳源時(shí),來源于江西水稻土的8個(gè)菌株對檸檬酸鐵的利用率較高,鐵還原率為84.34%93.81%,而對Fe(O H3的還原率為71.07%90.90%;來源于四川水稻土的8個(gè)菌株對檸檬酸鐵的還原率為83.78%93.52%,而對Fe(O H3的還原率為88.19%99.84%。嚴(yán)格厭氧菌株的鐵還原速率較快,在培養(yǎng)3d后20個(gè)菌株的鐵還原率都在90%以上,利用檸檬酸鐵的鐵還原率為90.49%97.93%,利用Fe(O H3的為94.03%99.57%。在LB液體培養(yǎng)基及檸檬

3、酸鐵液體培養(yǎng)基中,不同菌株的對數(shù)生長期為1025h,前者的延滯期較短,而后者的細(xì)胞產(chǎn)量較大?！窘Y(jié)論】由四川和江西水稻土中獲得了對檸檬酸鐵和Fe(O H3具有高效利用率的鐵還原菌株,其中嚴(yán)格厭氧菌株對2種鐵源的利用率均明顯大于兼性厭氧菌株。兼性厭氧鐵還原菌株為革蘭氏陰性芽孢桿菌,嚴(yán)格厭氧鐵還原菌株為革蘭氏陽性,有芽孢,屬梭狀桿菌。鐵還原菌的生長與Fe(的還原具有耦合關(guān)系。關(guān)鍵詞水稻土;鐵還原菌;分離純化;鐵還原率中圖分類號S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號167129387(20081020103207Isolation of iron2reducing bacteria in paddy soi

4、l and its Fe(reduction potential analysisWAN G Wei2min,QU Dong,XU Jia(College of Resources and Envi ronment,N ort hwest A&F Universit y,Yangling,S haanx i712100,ChinaAbstract:【Objective】The st udy isolated Fe(2reducing bacterium f rom paddy soil,compared t he dif2 ferent isolating result s of di

5、fferent dilution factor,and st udied t he Fe reducing2characters of different st rains.【Met hod】Fe(2reducing bacterium was isolated wit h P T YG plate and Fe(2cit rate medium f rom paddy soil of Jiangxi and Sichuan Province and t he ability of Fe(2reducing potential of bacterium was identified by Fe

6、(O H3cult ure and Fe(2cit rate medium met hod.The rate of Fe(2reducing and t he character curve of Fe(2reduction and growt h of different bacteria were compared.【Result】When u2 sing gluco se as carbo n so urce,8st rains facultative anaerobic bacteria f rom paddy of Jiangxi could reduce Fe(2cit rate

7、quickly and t he rate of Fe(2cit rate reduction was between84.34%-93.81%,but t he rate of Fe(O H3reduction was low,just between71.07%-90.90%.8st rains facultative anaerobic bacteria f rom paddy soil of Sichuan had efficient abilities to reduce Fe(and t he rate of Fe(2cit rate reduction was between83

8、.78%-93.52%,and t he rate of Fe(O H3reduction between88.19%-99.84%.The3收稿日期2007210215基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40271067,40741005作者簡介王偉民(1980-,男,陜西咸陽人,碩士,主要從事土壤環(huán)境化學(xué)研究。通訊作者曲東(1960-,男,河南陜縣人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事土壤環(huán)境化學(xué)研究。E2mail:dongqust rictly anaerobic bacteria from paddy soil of Jiangxi and Sichuan Province all had effi

9、cient ability to reduce Fe(.20st rains strictly anaerobic bacteria could reduce Fe(quickly,t he rate of Fe(2citrate reduc2 tion was between90.49%-97.93%and t he rate of Fe(O H3reduction between94.03%-99.57%.The lag p hase of different bacteria was almo st between10-25h in LB cult ure and Fe(2cit rat

10、e medium.Bac2 teria had short lag p hase in LB cult ure,and t he outp ut s of cells were larger in Fe(2citrate medium.【Conclusion】Bacteria st rains which can reduce Fe were isolated from paddy soil of Jiangxi and Sichuan,and t he isolated bacteria showed high utilization rate of Fe(2citrate and Fe(O

11、 H3.St rictly anaerobic iron re2 ducing bacterias utilization rate of t he two Fe resources were bot h higher t hen t hat of facultative anaerobic bacterias.Facultative anaerobic bacteria were rod2shaped gram2negative bacteria wit h spores;st rictly anae2 robic bacteria were gram2positive bacteria w

12、it h spores,belonging to f usiform bacillus.The Fe(2reduc2 tion was coupled wit h t he growt h of bacteria.K ey w ords:paddy soil;Fe(2reduction bacterium;isolation;Fe(2reduction rate鐵還原微生物通常指具有異化還原Fe(功能的微生物。異化Fe(還原是厭氧沉積物及水稻土中重要的生物化學(xué)過程之一,是一些特殊的微生物利用有機(jī)物為電子供體,在氧化有機(jī)物的同時(shí),以Fe(作為惟一的電子受體,使Fe(還原為Fe(,并由代謝過程中獲

13、得能量支持生長1。Yana等2和Lonergan等3綜述了厭氧環(huán)境中具有異化還原Fe(能力的微生物多樣性,并將已知的鐵還原微生物劃分到確定的系統(tǒng)發(fā)生種屬中。目前,已經(jīng)報(bào)道的鐵還原菌主要包括:嚴(yán)格厭氧菌Geobacteraceae中的一些成員,如由淡水沉積物中分離的Geobacter和海洋環(huán)境中的Des ul f uromonas 的一些種425;兼性厭氧菌S hew anell a內(nèi)的一些種627,以及一些噬溫菌和噬熱菌829。鐵還原菌在細(xì)菌域和古菌域幾乎都有分布10,這些微生物代謝能力十分強(qiáng)大,不但可利用纖維素等有機(jī)物,還可利用各種有機(jī)酸和烴類化合物及芳香族化合物作為碳源和能源11213。鐵

14、還原菌不僅可以還原鐵,而且還可以利用O2、NO3-、NO2-、S0,及多種形態(tài)的Fe(、MnO2和一些腐殖酸作為電子受體14216。此外,鐵還原菌還可以還原許多痕量金屬鹽,如Cr2O72-、AsO3-、SeO42-以及一些高價(jià)放射性金屬,如Co、U(、Tc(17218。Kashefi等19報(bào)道,一些異化鐵還原的嗜熱菌和嗜溫菌甚至可以將Au(還原為單質(zhì)金而沉降。鐵還原菌的多樣性及其在各種淹水環(huán)境中的廣泛分布,使人們認(rèn)識到其在環(huán)境中的重要意義。因此,對鐵還原菌的分離、提純、鑒定以及生理代謝和鐵還原機(jī)理的研究,已成為異化鐵還原研究中的熱點(diǎn)。針對水稻土中鐵還原菌分離純化的研究在國內(nèi)尚處于起步階段,分離

15、方法及分類也鮮見報(bào)道。我國水稻土資源豐富,加強(qiáng)水稻土中鐵還原機(jī)理的研究,無疑具有重要的理論和實(shí)際意義。然而,針對水稻土中異化Fe(還原過程的研究卻十分有限。因此,為了進(jìn)一步深入研究鐵還原菌的作用機(jī)理,本試驗(yàn)在借鑒前人研究成果的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了鐵還原微生物的分離和篩選,并對其Fe(還原微生物特性進(jìn)行了研究,這對于闡明土壤中氧化鐵的微生物還原機(jī)理,認(rèn)識異化鐵還原在稻田生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用,促進(jìn)水稻土中污染物的轉(zhuǎn)化與修復(fù)具有重要的理論和實(shí)際意義。1材料與方法1.1供試土壤供試水稻土分別采自四川省邛崍市迥龍鎮(zhèn)柏楊村(用“SC”表示和江西省安?？h竹江鄉(xiāng)店上村(用“J X”表示。土壤樣品自然風(fēng)干,磨細(xì),過孔

16、徑1 mm篩。供試土壤基本理化性狀見表1。表1供試土壤的基本理化性質(zhì)Table1The basic chemical2physic properties of soils土壤Soil 有機(jī)質(zhì)/(mgkg-1O.M.全鐵/(gkg-1Total iron無定形鐵/(gkg-1Amorphous iron游離鐵/(gkg-1Free ironp H細(xì)菌總數(shù)/(×108g-1Bacteria numberSC48.934.2 3.0811.697.349.14 J X23.919.5 1.94 6.48 4.848.961.2培養(yǎng)基組成1.2.1P T YG培養(yǎng)基蛋白胨0.25g/L,胰蛋

17、白胨0.25g/L,酵母膏0.5g/L,葡萄糖0.5g/L, MgSO47H2O0.6g/L,CaCl22H2O0.07g/L,401西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版第36卷瓊脂粉10g/L,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基p H為7.0。1.2.2檸檬酸鐵培養(yǎng)基檸檬酸鐵3.3g/L,N H4Cl 1g/L,CaCl22H2O0.07g/L,MgSO47H2O0.6 g/L,K2HPO43H2O0.722g/L,KH2PO40.25g/L,葡萄糖10g/L,瓊脂粉10g/L,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基p H為7.0。當(dāng)去除瓊脂粉后即為檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基。1.3鐵還原微生物的分離與純化1.3.1水稻土中厭氧微生物的恢復(fù)培養(yǎng)稱取供試水

18、稻土樣品10.00g于100mL血清瓶中,加入1 mL人工合成的Fe(O H3懸液(含F(xiàn)e量為15.4 mg/mL及50mL去離子水,在30下靜置暗光培養(yǎng)1周。將培養(yǎng)后的土壤懸液于700r/min離心10 min,取上清液作為微生物接種液。1.3.2兼性厭氧鐵還原菌株的分離純化將1.3.1中的接種液稀釋100倍,取100L在P T YG固體培養(yǎng)基平板上涂布,培養(yǎng)皿用封口膜密封,以減少空氣中O2的影響。置30培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2d。選擇菌落分布均勻的平板,全部挑取單菌落,分別接入檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶采用10mL 的血清瓶,每瓶加檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基5mL,沖氮?dú)?min,密封。如果在培養(yǎng)

19、過程中檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基由黃綠色逐漸變?yōu)榘咨?表明檸檬酸鐵已被還原,此菌株具有還原Fe(的功能。據(jù)此分離篩選目的菌株。吸取含目的菌株的培養(yǎng)液100L,在P T YG固體培養(yǎng)基平板上涂布,培養(yǎng)皿用封口膜密封,于30避光培養(yǎng)2d。最大量挑取單菌落,轉(zhuǎn)接于裝滿LB液體培養(yǎng)基的15mL帶蓋菌種管中,蓋緊管蓋,30厭氧培養(yǎng)1d。將培養(yǎng)后的菌種管于3000r/min離心15min,棄上清液,用無菌水洗滌2次,再用1mL無菌水懸浮沉淀制得菌液,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,4000r/min離心10min,棄上清液,于4保存。1.3.3嚴(yán)格厭氧鐵還原菌株的分離純化吸取稀釋103104倍的1.3.1中接種液1mL

20、,在檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基斜面上均勻涂布(檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基斜面在25mL的血清瓶中制備,將血清瓶加橡膠蓋,充無菌氮?dú)?5min,除去瓶中氧氣,用鋁蓋密封。于30避光培養(yǎng)34d。當(dāng)鐵還原微生物開始生長時(shí),培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵會逐漸被還原,培養(yǎng)基的顏色由黃綠色逐漸變?yōu)榘咨?。將斜面上生長的、能夠還原檸檬酸鐵的單菌落分別挑入檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),進(jìn)一步篩選具有鐵還原功能的目的菌株。挑選具有還原檸檬酸鐵能力的培養(yǎng)瓶作為接種液,在檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基上再次涂布,分離純化目標(biāo)菌株。最大量挑取單菌落,轉(zhuǎn)接于裝滿LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁,制得菌液,轉(zhuǎn)入1.5mL 離心管中,4000r/min離心10min,棄上清

21、液,于4保存。1.4鐵還原特征曲線與鐵還原率的測定選擇Fe(為惟一的電子受體,鐵源分別采用檸檬酸鐵溶液(含F(xiàn)e量為658.2mg/L和人工合成的Fe(O H3懸液(含F(xiàn)e量為616.2mg/L。在若干個(gè)10mL血清瓶中,分別加入1mL鐵源,1mL5 g/L的氯化銨,加蓋后于121滅菌30min,冷卻后開蓋,加入過0.22m濾膜的25mmol/L磷酸緩沖液1mL,300mmol/L葡萄糖溶液1mL,分別接種1.3中分離純化的菌液1mL,通氮?dú)獬テ恐蠴2,蓋上橡膠蓋后用鋁蓋密封。試驗(yàn)處理中,以不加菌液(補(bǔ)1mL無菌水為對照(C K,以接種不同菌株但不加碳源的處理(補(bǔ)1mL無菌水為對比,用C K1

22、、C K2、C K3、C K4表示。30下暗光培養(yǎng),分別在不同培養(yǎng)時(shí)間下測定培養(yǎng)瓶中Fe(濃度的變化。不同菌株的鐵還原率依據(jù)測定的Fe(濃度與體系中加入的總Fe(濃度(Fe T比值計(jì)算,用百分?jǐn)?shù)(%表示。1.5鐵還原菌生長曲線的測定1.5.1不同菌株在LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線將純化擴(kuò)繁后的菌體用適量LB液體培養(yǎng)基懸浮制得接種液。取12支裝有一半LB液體培養(yǎng)基的帶蓋菌種管,按無菌操作法向每管準(zhǔn)確加入1mL 接種液,接種后管中剩余空間用LB液體培養(yǎng)基補(bǔ)滿,蓋緊管蓋后上下?lián)u蕩,使菌體混勻。以不接種的裝滿LB液體培養(yǎng)基管為對照(C K。在30下避光培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)的0,2,4,6,8,10,12,1

23、6,20, 26,32,40h取出,放入冰箱中貯存,待測。取樣結(jié)束后,以未接種的菌種管(C K為測定空白,選用600nm波長,按取樣先后進(jìn)行光密度測定,以菌懸液的光密度值(OD600為縱坐標(biāo)20、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)制得菌體生長曲線。1.5.2不同菌株在檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中的生長曲線將純化擴(kuò)繁后的菌體用適量無菌水懸浮制得接種液,分別轉(zhuǎn)接到檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中,接種量為1%(體積分?jǐn)?shù)。然后將接種瓶密封,充無菌氮?dú)?30下避光培養(yǎng)。分別在不同時(shí)間段采樣,以未接種的菌種管為測定空白,測定600nm波長的光密度值(OD600,繪制菌體生長曲線。同時(shí),測定培養(yǎng)體系中檸檬酸鐵的還原率,考察鐵還原菌株的生長與鐵

24、還原的耦聯(lián)情況。501第10期王偉民等:水稻土中鐵還原菌的分離純化及鐵還原能力分析1.6采樣及測定方法吸取1mL培養(yǎng)液,置于4mL0.5mol/L鹽酸溶液中浸提,在30下靜置浸提24h21,平行3份。將提取液過0.22m濾膜,濾液中Fe(濃度采用鄰菲啰啉分光光度法測定22。2結(jié)果與分析2.1鐵還原微生物的分離與純化分離兼性厭氧鐵還原菌時(shí),使用P T YG固體培養(yǎng)基和檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基。P T YG固體培養(yǎng)基平板接種時(shí)的稀釋倍數(shù)由多級稀釋法確定。由表2可知,選擇100倍的稀釋倍數(shù)比較適宜。通過檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基可初步對具有鐵還原功能的菌株進(jìn)行篩選。由江西和四川水稻土中分離的93和85株菌中,有3

25、9和42株菌在培養(yǎng)過程中有明顯的鐵還原現(xiàn)象。通過Fe(濃度測定,江西和四川水稻土中分別有14和26株菌的鐵還原率在70%以上。分離嚴(yán)格厭氧鐵還原菌時(shí),使用檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基(斜面。接種液稀釋倍數(shù)為103104倍。在控制嚴(yán)格厭氧條件下,在斜面上生長的鐵還原菌能夠?qū)ⅫS綠色的檸檬酸鐵還原為白色。直接從檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基表面挑取具有鐵還原能力的單菌落,接入檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基進(jìn)一步進(jìn)行鐵還原能力鑒定。表2不同稀釋倍數(shù)下P T YG平板培養(yǎng)基的菌落數(shù)Table2The number of CFU on the P T YG platein different dilution factors水稻土浸提液E

26、xtracted solutionof paddy soil稀釋倍數(shù)Dilution factor101102103 J X524.7±101.653.3±18.3 4.7±1.5SC956.0±92.0149.7±7.117.3±1.5 2.2不同菌株鐵還率的比較由江西和四川水稻土中分離獲得的部分兼性厭氧菌株,在以葡萄糖為碳源時(shí)對檸檬酸鐵和Fe(O H3的還原率見表3。表3兼性厭氧條件下分離的不同菌株的鐵還原率(培養(yǎng)6dTable3Fe(2reduction rate of different facultative anaerob

27、ic bacteria(incubated for6days土壤Soil 菌株編號Number ofstrain檸檬酸鐵還原率/%Ferric citratereduction rateFe(O H3還原率/%Fe(O H3reduction rate土壤Soil菌株編號Numberof strain檸檬酸鐵還原率/%Ferric citratereduction rateFe(O H3還原率/%Fe(O H3reduction rateJ X J X2o290.7979.57J X2o384.3475.72J X2o491.5471.07J X2o586.2383.21J X2o689.64

28、78.15J X2o1893.2490.90J X2o10593.8173.70J X2o10692.3072.89SCSC2o783.7892.97SC2o988.8494.43SC2o1291.3894.01SC2o1791.7793.18SC2o1893.1388.19SC2o2493.0294.64SC2o4293.5289.44SC2o4693.1399.84表4嚴(yán)格厭氧條件下分離的不同菌株的鐵還原率(培養(yǎng)3dTable4The Fe(2reduction rate of different strictly anaerobic bacteria(incubated for3days

29、土壤Soil 菌株編號Number ofstrain檸檬酸鐵還原率/%Ferric citratereduction rateFe(O H3還原率/%Fe(O H3reduction rate土壤Soil菌株編號Numberof strain檸檬酸鐵還原率/%Ferric citratereduction rateFe(O H3還原率/%Fe(O H3reduction rateJ X J X2a397.9396.33J X2a597.6697.75J X2a696.2495.51J X2a892.9296.50J X2a995.1797.69J X2a1094.3696.53J X2a129

30、3.9897.23J X2a1797.2094.03J X2a2093.5599.45J X2a2292.0796.82SCSC2a1194.7095.33SC2a1296.1097.69SC2a1393.8994.52SC2a1493.0695.40SC2a1590.7899.57SC2a1694.1995.06SC2a1794.0494.18SC2a1891.7894.05SC2a1990.4996.68SC2a2495.4195.73由表3可知,來源于江西水稻土的8個(gè)菌株,對檸檬酸鐵的利用率均較高,鐵還原率在84.34% 93.81%,而對Fe(O H3的還原率為71.07%90.90%

31、,表明在6d培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),這些菌株較易于還原離子態(tài)的鐵。來源于四川水稻土的8個(gè)菌株,對檸檬酸鐵的還原率為83.78%93.52%,而對601西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版第36卷Fe (O H 3的還原率為88.19%99.84%,對Fe (O H 3的利用率明顯高于檸檬酸鐵,表明四川水稻土中分離的菌株鐵還原特征與江西水稻土中分離的菌株不同。以葡萄糖為碳源時(shí),嚴(yán)格厭氧條件下分離的不同菌株對檸檬酸鐵和Fe (O H 3的還原率列于表4。由表4可知,總體而言,嚴(yán)格厭氧條件下分離的菌株鐵還原速率較快,在培養(yǎng)3d 后,20個(gè)菌株的鐵還原率均在90%以上,其中利用檸檬酸鐵的鐵還原率為90.49%97.9

32、3%,利用Fe (O H 3的為94.03%99.57%。各菌株對2種鐵源的利用率均明顯大于兼性厭氧菌株。2.3不同菌株的鐵還原特征曲線從兼性厭氧及嚴(yán)格厭氧的鐵還原菌株中各選出4個(gè)株菌,在厭氧條件下以人工合成的Fe (O H 3為惟一電子受體進(jìn)行培養(yǎng),測定不同培養(yǎng)時(shí)間下Fe (濃度的變化,得到的鐵還原特征曲線見圖1和圖2。由圖1可知,4個(gè)兼性厭氧菌株在培養(yǎng)1d 后,Fe (還原進(jìn)入快速增長期,4d 后Fe (還原率基本達(dá)到穩(wěn)定,除J X 2o6菌株的Fe (O H 3還原率穩(wěn)定在80%左右外,其他3個(gè)菌株均穩(wěn)定在90% 以上。圖14株兼性厭氧菌的鐵還原特征曲線Fig.1The characte

33、r curve of Fe (2reduction of 4strains of facultative anaerobic bacteria圖24株嚴(yán)格厭氧菌的鐵還原特征曲線Fig.2The character curve of Fe (2reduction of 4strains of strictly anaerobic bacteria在4個(gè)嚴(yán)格厭氧菌株的鐵還原過程中,在培養(yǎng)1.5d 后,J X 2a10和J X 2a8菌株的鐵還原率迅速增大,較SC 2a15和SC 2a17菌株提前0.5d ,培養(yǎng)3d 后4個(gè)嚴(yán)格厭氧菌株的Fe (O H 3還原率均達(dá)到90%以上(圖2。在培養(yǎng)體系中,

34、不接菌的C K 及接種4株菌但不加碳源的對照(C K 1、C K 2、C K 3、C K 4的鐵還原率幾乎為一條直線,說明沒有微生物參與及微生物生長受到限制時(shí),Fe (O H 3的還原反應(yīng)幾乎不會發(fā)生。2.4不同鐵還原菌株的生長曲線不同鐵還原菌株在LB 液體培養(yǎng)基及檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中的生長曲線分別如圖3和圖4所示 。圖3不同鐵還原菌株在LB 液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3The character curve of Fe (2reduction of 4strains of facultative anaerobic iron reducing bacteria圖4不同鐵還原菌株在檸檬酸鐵

35、液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.4The character curve of Fe (2reduction of 4strains of strictly anaerobic iron reducing bacteria由圖3和圖4可知,總體上看,不同鐵還原菌株在LB 液體培養(yǎng)基中停滯期比較短,培養(yǎng)8h 左右生長曲線就進(jìn)入對數(shù)期;在檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中,由于其微生物繁殖較快,故在測定生長曲線時(shí)將菌懸701第10期王偉民等:水稻土中鐵還原菌的分離純化及鐵還原能力分析108 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào) ( 自然科學(xué)版 第 36 卷 液稀釋了 5 倍 。在培養(yǎng) 15 25 h , 不同菌株的生長 曲線可進(jìn)

36、入對數(shù)期 。從測定的檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基 中菌懸液的光密度比較 , 其微生物生物量遠(yuǎn)大于用 LB 液體培養(yǎng)基 。 選擇嚴(yán)格厭氧菌株 (J X2a10 和兼性厭氧菌株 ( SC2o24 ,同時(shí)測定其生長曲線和鐵還原特征曲線 , 結(jié)果見圖 5 和圖 6 。從圖 5 和圖 6 可以看出 ,2 株菌 的生長曲線和鐵還原特性曲線有著密切的相關(guān)性 。 伴隨鐵還原細(xì)菌生長進(jìn)入對數(shù)期 , 體系中的 Fe ( 還原率也進(jìn)入快速增長期 ,表明 Fe ( 的還原和鐵 還原菌的生長耦合在一起 。 3 討 論 本研究在分離兼性厭氧菌時(shí)發(fā)現(xiàn) , 四川水稻土 樣品中的微生物數(shù)量顯著多于江西水稻土樣品 。在 P T YG 固體

37、平板培養(yǎng)基上 , 四川水稻土樣品中可培 養(yǎng)的微生物數(shù)量是江西水稻土樣中的 2 4 倍 ( 表 2 。其中 SC 土樣中鐵還原率大于 70 %的菌株檢出 率約為 31 % ,而 J X 土樣中的檢出率僅為 15 %左右 , 這一結(jié)果可能與不同地區(qū)的耕作環(huán)境有關(guān) 。采自江 西的水稻土屬于水稻連作 , 而采自四川的水稻土為 水2旱輪作 ,導(dǎo)致兼性厭氧菌的數(shù)量有一定差異 。另 外 ,四川及江西兩地水稻土理化性質(zhì)的差異 ,可能也 是影響微生物種群特征及數(shù)量差異的因素 。 本試驗(yàn)通過比較四川和江西水稻土樣品中鐵還 原菌的形態(tài)特征及鐵還原特征發(fā)現(xiàn) , 四川和江西水 稻土樣品中的兼性厭氧鐵還原菌形態(tài)上并無明顯

38、差 異 ,一般都為淺棕色 ,菌落邊緣不規(guī)則 ,隆起 ,表面粘 滑 ,透光性差 ,直徑 3 mm 左右 , 染色鏡檢為革蘭氏 陰性芽孢桿菌 。但是四川水稻土樣品中分離出的兼 性厭氧鐵還原菌對氧化鐵的還原能力明顯高于江西 水稻土樣品 。這可能是由兩種水稻土樣品理化性質(zhì) 的差異造成的 。四川水稻土樣品中全鐵含量 、 游離 鐵含量以及有機(jī)質(zhì)含量均明顯高于江西水稻土樣 品 。對江西和四川水稻土樣品中分離出的嚴(yán)格厭氧 鐵還原菌 ,從菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察可以看出 ,菌 株具有一些共同特征 : 菌落白色 ,粘滑 ,隆起 ,透光性 Fig. 5 Growt h curve and Fe ( 2reductio

39、 n of st rictly anaerobic bacteria J X2a10 圖 5 X2a10 的生長曲線和鐵還原特征曲線 J 差 ,邊緣光滑 , 直徑 2 mm 左右 , 革蘭氏陽性 , 有芽 孢 ,屬 梭 狀 桿 菌 ; 其 對 氧 化 鐵 的 還 原 率 一 般 都 在 94. 03 %99. 57 % 。通過對江西水稻土和四川水稻 土中鐵還原菌的研究可以看出 , 鐵還原菌在 2 種水 稻土中都有較多的分布 。比較嚴(yán)格厭氧鐵還原菌和 兼性厭氧鐵還原菌在 Fe ( O H 3 培養(yǎng)基中的鐵還原 特征曲線 ,可以看出 ,嚴(yán)格厭氧鐵還原菌對鐵的還原 速率明顯大于兼性厭氧鐵還原菌 。

40、在本研究中 ,只是通過單菌落篩選 ,由土壤中分 離出不同的具有鐵還原功能的菌株 , 對這些菌株還 有待進(jìn)行系統(tǒng)的分類鑒定 。另一方面 , 由于試驗(yàn)中 僅以葡萄糖作為惟一碳源 , 可能會限制一些利用特 殊碳源的鐵還原菌的生長 , 也難以獲得不同碳源利 用能力的信息 。鑒于微生物呼吸代謝的多樣性 , 選 擇其他碳源 ,如乙酸鹽 、 乳酸鹽或丙酮酸鹽等代替葡 萄糖 ,還有待進(jìn)行深入探討 。 4 結(jié) 論 由四川和江西水稻土中分離獲得了具有鐵還原 能力的兼性厭氧及嚴(yán)格厭氧菌株 。通過對檸檬酸鐵 和人工合成 Fe ( O H 3 2 種培養(yǎng)基中鐵還原率的比 較 ,都表現(xiàn)出較高的 Fe ( 還原率 。不同水

41、稻土中 分離的兼性厭氧及嚴(yán)格厭氧菌株的鐵還原特征具有 一定差異 , 嚴(yán)格厭氧菌株對 2 種鐵源的利用率均明 顯大于兼性厭氧菌株 。兼性厭氧鐵還原菌株為革蘭 氏陰性芽孢桿菌 , 嚴(yán)格厭氧鐵還原菌株為革蘭氏陽 Fig. 6 Growt h curve and Fe ( 2reduction of st rictly anaero bic bacteria SC2o24 圖 6 SC2o24 的生長曲線和鐵還原特征曲線 第 10 期 王偉民等 : 水稻土中鐵還原菌的分離純化及鐵還原能力分析 109 性 ,有芽孢 ,屬梭狀桿菌 。不同菌株的對數(shù)生長期為 1025 h ,且鐵還原菌的生長與 Fe ( 的

42、還原具有 耦合關(guān)系 。 參考文獻(xiàn) 1 Anderson R T ,Lovley D R. Hexadecane decay by met hanogen2 2 Yana B , Barbara A ,Lovley D R. Computational p rediction of 3 Lonergan D J , Phillip s E J P ,Lovley D R. Phylogenetic analysis of dissimilatory Fe ( 2reducing bacteria J . J Bacteriology , crobiol ,1995 ,164 :4062413.

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