殼聚糖_明膠網(wǎng)絡(luò)_羥基磷灰石復(fù)合材料支架的研究_成骨細(xì)胞培養(yǎng)

1、組織工程殼聚糖2明膠網(wǎng)絡(luò) 羥基磷灰石復(fù)合材料支架的研究成骨細(xì)胞培養(yǎng)趙峰1尹玉姬1姚康德1郭剛2王寶利2張鏡宇2章明放3【摘要】目的研究大鼠顱骨成骨細(xì)胞在殼聚糖2明膠網(wǎng)絡(luò) 羥基磷灰石(CS2Gel HA復(fù)合材料支架上的生長(zhǎng)情況。方法將原代培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞第3代,密度為1.01×106 m l懸液,種植于孔隙率分別為85.20%、90.40%和95.80%的CS2Gel HA支架材料中,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)種植后3天,1、2及3周的細(xì)胞增殖曲線,采用H E和von Ko ssa染色方法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、骨樣組織形成和礦化沉積情況。結(jié)果大鼠顱骨成骨細(xì)胞在孔隙率為85.20%的支架中增殖較慢,

2、在孔隙率為90.40%和95.80%的CS2Gel HA復(fù)合材料支架上生長(zhǎng)良好,增殖較快,周?chē)置谟写罅考?xì)胞外基質(zhì),3周時(shí)局部已出現(xiàn)骨樣組織,且細(xì)胞 支架結(jié)構(gòu)物有利于鈣質(zhì)沉積。結(jié)論CS2Gel HA復(fù)合材料支架有望成為培養(yǎng)自體成骨細(xì)胞的材料,以重建新的骨組織?！娟P(guān)鍵詞】組織工程殼聚糖2明膠網(wǎng)絡(luò) 羥基磷灰石成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)TI SSUE ENGI NEER I NG STUDY ON CH I T OSAN-GELATI N HYD R OX YAPATI TE COM POSI TE SCAFF OLD S OSTEOB LASTS CUL TURE ZH A O F eng,Y IN Y

3、u2j i,YA O K ang2d e,et al.R esearch Institu te of P olym eric M aterials,T ianj in U niversity.T ianj in,P.R.Ch ina300072【Abstract】ObjectiveTo investigate the behavi o r of rat calvarial o steoblasts cultured on ch ito san2 gelatin hydroxyapatite(CS2Gel HAcompo site scaffo lds.M ethodsT he rat calv

4、arial o steoblasts(the3rd passagew ere seeded at a density of1.01×106cells m l onto the CS2Gel HA compo site scaffo lds having po ro sity 85120%,90140%and95180%.Cell num ber w as counted after cultured fo r3days,1w eek,2w eek s and3w eek s.Cell p ro liferati on,bone2like tissue fo r m ati on,an

5、d m ineralizati on w ere separately detected by H E,von Ko ssah isto logical staining techniques.ResultsT he CS2Gel HA compo site scaffo lds suppo rted the attachm ent of seededrat calvarial o steoblasts.Cells p ro liferated faster in scaffo ld w ith h igher po ro sity90140%and95.80%than scaffo ld w

6、 ith low er po ro sity85120%.T he o steoblasts scaffo ld constructs w ere feasible fo r m ineral depo siti on,and bone2like tissue fo r m ati on in3w eek s.ConclusionT h is study suggests the feasibility of using CS2Gel HA compo site scaffo lds fo r bone tissue engineering.【Key words】T issue enginee

7、ringCh ito san2gelatin hydroxyapatiteO steoblastsExtracellular m atrixFoundation ite m s:N ati onalBasic Science R esearch and D evelopm ent Grants(G1999054305;N ati onalN atural Science Foundati on of Ch ina(59883002骨具有再生和自行修復(fù)能力,因腫瘤切除、外傷、骨疾病及骨異常生長(zhǎng)所造成的骨缺損,在單純依靠骨自行修復(fù)無(wú)法愈合的情況下,則需采用手術(shù)治療。傳統(tǒng)的移植方式主要有自體骨移植和

8、異體骨移植,但自體移植骨源有限,而異體骨移植又有傳播疾基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(973:組織工程的基本科學(xué)問(wèn)題(G1999054305;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(59883002作者單位:1天津大學(xué)高分子材料研究所(天津,300072;2天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所,3病理科病和免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題。近年來(lái)開(kāi)發(fā)的組織工程學(xué)研究方法13。其基本方法是將體外培養(yǎng)的高濃度種子細(xì)胞種植于具有生物相容性和可降解性的天然或人工合成的細(xì)胞外基質(zhì)(ex tracelluar m atrixes,EC M上,然后將此細(xì)胞 支架結(jié)構(gòu)物移植到體內(nèi),以誘發(fā)所希望的細(xì)胞響應(yīng)(粘連、分化和增殖。在體內(nèi)細(xì)胞繼續(xù)增殖

9、,而支架則隨著新組織的形成在體內(nèi)逐漸降解,其產(chǎn)物被機(jī)體吸收,從而達(dá)到修復(fù)組織的目的。1材料與方法1.1材料DM E M培養(yǎng)基(Gibco,含10%胎牛血清(FB S,Gibco;0.25%胰蛋白酶(Sigm a;0.02% ED TA(A ldrich;培養(yǎng)用三蒸水。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的準(zhǔn)備將相分離法制備4的孔隙率分別為85.20%、90.40%和95.80%的殼聚糖2明膠網(wǎng)絡(luò) 羥基磷灰石(ch ito san2gelatih hydroxyap atite,CS2Gel HA復(fù)合支架材料裁剪成直徑7mm,厚度1.5mm的圓盤(pán)狀,置于48孔培養(yǎng)板的孔底,75%的乙醇溶液浸泡1

10、小時(shí),用三蒸水反復(fù)沖洗,除去水分,在密閉環(huán)境中用高效紫外燈照射1小時(shí)。滅菌后的材料用培養(yǎng)液浸泡30分鐘,除去多余液體。1.2.2支架材料中成骨細(xì)胞的種植將原代培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞(第3代稀釋至密度為1.01×106 m l,用加樣器吸取0.1m l細(xì)胞懸液,均勻加入到支架材料中,于培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3小時(shí),再向培養(yǎng)孔中加入充足的培養(yǎng)液。每23天更換培養(yǎng)液。1.2.3支架材料中成骨細(xì)胞的計(jì)數(shù)將培養(yǎng)到3天,1、2及3周的標(biāo)本從培養(yǎng)液中取出,用PB S液沖洗兩次,加入0.7m l消化液(含0125%胰蛋白酶, 0102%ED TA消化35分鐘,用吸管輕輕吹打數(shù)次,再加入0.1m l FB S

11、以終止消化,充分?jǐn)D出支架中液體后,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板記數(shù)。1.2.4組織學(xué)切片及染色將培養(yǎng)到1、2及3周的標(biāo)本從培養(yǎng)液中取出,PB S液沖洗兩次,用10%中性福爾馬林溶液在4固定24小時(shí),以梯度濃度的乙醇溶液逐級(jí)脫水。石蠟包埋并按表面或斷面切片(46m,H E、von Ko ssa染色。2結(jié)果2.1成骨細(xì)胞在復(fù)合材料支架中的增殖成骨細(xì)胞種植于相分離法制備的孔隙率分別為85.20%,90.40%和95.80%的CS2Gel HA復(fù)合材料支架中培養(yǎng)后,第3天,成骨細(xì)胞在孔隙率為90140%的復(fù)合材料中存留最多,孔隙率為85.20%的材料中存留最少?？紫堵蕿?5.80%和90.40%的支架中呈良好生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)

12、,3周內(nèi)可見(jiàn)數(shù)量增多,而孔隙率為85.20%的支架材料中生長(zhǎng)狀態(tài)略差(圖1。2.2組織學(xué)觀察1周時(shí)成骨細(xì)胞在孔隙率為90.40%的復(fù)合材料支架上黏附性良好,形狀呈圓形或柱狀,核為圓形或橢圓形;支架上沉積有染色后呈淺粉紅色的EC M (圖2。3周時(shí)材料周邊細(xì)胞密度增大,包埋在其周?chē)置诖罅縀C M中,幾乎將材料孔洞填滿,并與材料混合在一起(圖3,活體結(jié)構(gòu)物中局部還可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞嵌于含有大量EC M的骨樣組織中(圖4 。圖1成骨細(xì)胞在三種孔隙率的復(fù)合材料支架中的增殖曲線F ig.1The proliferation curves of osteoblasts i n three porositysc

13、affolds2.3復(fù)合材料支架的礦化成骨細(xì)胞增殖的同時(shí),不同孔隙率的材料、細(xì)胞分泌物和骨樣組織中均有鈣質(zhì)沉積,3周時(shí)已較為密集(圖5。3討論細(xì)胞所分泌的EC M將細(xì)胞隔離且提供信息,同時(shí)作為調(diào)節(jié)劑(細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的釋放載體,在調(diào)節(jié)與其相聯(lián)系的細(xì)胞行為方面起著十分積極和復(fù)雜的作用。骨組織工程研究重點(diǎn)是尋求能夠作為細(xì)胞移植與引導(dǎo)新骨生長(zhǎng)的人工EC M,它具有良好的生物相容性、可降解性;良好的骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性;負(fù)荷最大量細(xì)胞的高滲透性;支持骨細(xì)胞生長(zhǎng)和功能分化的表面化學(xué)與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);可作為調(diào)節(jié)劑如骨形成蛋白、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子2和血小板衍生生長(zhǎng)因子的釋放載體以促進(jìn)骨形成;可消毒性5。有關(guān)成骨細(xì)胞在人

14、工EC M三維支架中的培養(yǎng)已有報(bào)道,如膠原蛋白基質(zhì)、聚乙醇酸網(wǎng)絡(luò)、聚乳酸和HA生物陶瓷等69。而膠原蛋白力學(xué)強(qiáng)度差,其同種或異種來(lái)源物有可能引起免疫排斥反應(yīng),且細(xì)胞系膠原純化轉(zhuǎn)染也可能帶來(lái)感染。聚乙醇酸不僅力學(xué)強(qiáng)度低,厚度薄(100m,使其在治療較大或大塊骨缺損方面有一定難度。聚乳酸降解會(huì)使局部酸性增強(qiáng)而引起炎性反應(yīng)。純HA陶瓷支架降解速圖21周時(shí),成骨細(xì)胞在復(fù)合材料支架中黏附性良好,并沉積有淺粉紅色的細(xì)胞外基質(zhì)(HE×400圖33周時(shí),成骨細(xì)胞在復(fù)合材料周邊密度增大,包埋在大量細(xì)胞外基質(zhì)中(HE×400圖43周時(shí),成骨細(xì)胞在復(fù)合材料支架中形成骨樣組織,局部有少數(shù)細(xì)胞嵌于大

15、量細(xì)胞外基質(zhì)中(HE×400圖53周時(shí),成骨細(xì)胞在復(fù)合支架材料中有骨化傾向,并有鈣質(zhì)在復(fù)合支架上沉積(von Kossa染色×400F ig.2O steoblasts attached well on the chitosan-gelati n hydroxyapatite co mposite scaffold,and pi nkish EC M s for med at1week(HE×400F ig.3O steoblasts proliferated i n the osteoblasts scaffold con struct and were e m

16、bedded i n the secreted EC M s at3weeks(HE×400 F ig.4Bone-like tissue for med i n the steoblasts scaffold con structs at3weeks,which is disti nguished by few cells e mbedded i n greater abundance of EC M s(HE×400F ig.5O steoblasts scaffold con struct had osteosis trend at3weeks,and calc iu

17、 m deposited i n the co mposite,EC M s and bone-like tissue(von Kossa×400度慢,不宜被新的自體骨長(zhǎng)入而替代,并有可能改變新生骨的力學(xué)強(qiáng)度。天然EC M為物理和化學(xué)交聯(lián)的蛋白質(zhì)和糖胺聚糖(glyco sam inoglacan s,GA Gs網(wǎng)絡(luò),其主要成分為粘連蛋白和纖維蛋白與GA Gs,對(duì)硬組織而言,同時(shí)含有納米級(jí)HA。CS結(jié)構(gòu)類似于GA Gs,是一種生物可降解的聚陽(yáng)離子多糖,它能與細(xì)胞膜負(fù)電成分呈現(xiàn)非特異相互作用10,并可調(diào)控生物活性分子釋放11,促進(jìn)骨形成。與膠原蛋白結(jié)構(gòu)相似,其中含有天冬氨酸2甘氨酸2谷氨

18、酸2丙氨酸細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域,利于細(xì)胞粘連。HA具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性,是骨組織的成分。據(jù)此,我們構(gòu)建了成分類似于自然骨的CS2Gel HA復(fù)合材料支架,實(shí)驗(yàn)表明,成骨細(xì)胞在適當(dāng)孔隙率的支架中黏附性和生長(zhǎng)狀態(tài)均良好,呈組織化趨向,且不同孔隙率的材料和細(xì)胞合成EC M均非常有利于鈣質(zhì)沉積,CS2 Gel HA復(fù)合材料支架有望成為新的工程化骨組織替代材料。 4參考文獻(xiàn)1L anger R,V acanti JP.T issue engineering.Science,1993;260 (5110:9202C rane G M,Ishaug SL,M iko s A G.Bone tissue

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