小鼠抗雙鏈DNA抗體dsDNA酶聯(lián)免疫分析

1、上海信帆生物科技有限公司1小鼠抗雙鏈DNA抗體（dsDNA酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書第一部分 ELISA 簡介ELISA 是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（En zyme-Li nked Immu no sorb nent Assay ）的簡稱。 自上世紀(jì) 70 年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原 或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成

2、的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì) 的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地 放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。第二部分 ELISA 的樣本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備在收集樣本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測的樣本，及時(shí)儲(chǔ)存在4C備用。對于隔天再檢測的樣本，及時(shí)分裝后凍存在-20C備用，有條件的，最好-70C凍存?zhèn)溆?。?biāo)本應(yīng)避免

3、反復(fù)凍融。液體類標(biāo)本：包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。1.血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。3.尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份

4、時(shí)，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。5.培養(yǎng)細(xì)胞：檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（ PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再 次離心。6.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持 2-8C的溫度。加入一定量的PBS（ PH7.4），或組織蛋白萃取試齊山用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。離心20 分鐘左右（

5、2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。7.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)上海信帆生物科技有限公司2行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.8.不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP 活性。第三部分 ELISA 試劑盒的檢測目的和實(shí)驗(yàn)原理1. 檢測目的本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中抗雙鏈DNA 抗體（dsDNA 含量。2. 實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中小鼠抗雙鏈DNA 抗體（dsDNA 水平。用純化的小鼠抗雙鏈 DNA 抗體（dsDNA

6、 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入抗雙鏈 DNA 抗體（dsDNA ，再與 HRP 標(biāo)記的抗雙鏈 DNA 抗體（dsDNA 抗體結(jié)合，形成抗體-抗 原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抗雙鏈DNA 抗體（dsDNA 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（0D 值），通過標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠抗 雙鏈 DNA抗體（dsDNA 濃度。第四部分試劑盒組成試劑盒組成48T96T保存說明書1 份1 份圭寸板膜2 片（48）2 片（96）密封袋1 個(gè)1 個(gè)

7、酶標(biāo)包被板1X481X962-8C保存標(biāo)準(zhǔn)品（960ng/L）0.5mlX1 瓶0.5mlX1 瓶2-8C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5mlX1 瓶1.5mlX1 瓶2-8C保存酶標(biāo)試劑3 mlX1 瓶6 mlX1 瓶2-8C保存樣品稀釋液3 mlX1 瓶6 mlX1 瓶2-8C保存顯色劑 A 液3 mlX1 瓶6 mlX1 瓶2-8C保存顯色劑 B 液3 mlX1 瓶6 mlX1 瓶2-8C保存終止液3mlX1 瓶6mlX1 瓶2-8C保存濃縮洗滌液（20 倍）20mlX1瓶（30 倍）20mlX1瓶2-8C保存第五部分操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管

8、中進(jìn)行稀釋。480n g/L5 號標(biāo)準(zhǔn)品1504的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 1504標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液240ng/L4 號標(biāo)準(zhǔn)品1504的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 1504標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液120n g/L3 號標(biāo)準(zhǔn)品1504的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 1504標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液60n g/L2 號標(biāo)準(zhǔn)品1504的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 1504標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液30n g/L1 號標(biāo)準(zhǔn)品1504的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 1504標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液上海信帆生物科技有限公司32.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、上海信帆生物科技有限公司4待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 訕，待測樣品孔中先加樣品稀釋

9、液 40M,然后再加待測樣品 10 訕（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡 不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3.溫育：用封板膜封板后置 37C溫育 30 分鐘。4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50M，空白孔除外。7.溫育：操作同 3。8.洗滌：操作同 5。9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50J，再加入顯色劑 B50J，輕輕震蕩混勻，37C避光顯色 10 分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50 訕，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色

10、）。11. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止 后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。12. 操作程序總結(jié)：準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37C反應(yīng)30分鐘弋T洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37C反應(yīng)30分鐘Z洗板5次，加入顯色液爪B, 37C顯色10分鐘加入終止液15分鐘之內(nèi)讀0D值上海信帆生物科技有限公司5計(jì)算上海信帆生物科技有限公司6（此圖僅供參考）第七部分注意事項(xiàng)1 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4.請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本0D 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 0D 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計(jì) 算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數(shù)（Xnx