Q-PCR常見問(wèn)題及解決方法

1、QPC噂見問(wèn)題及其分析解決方法一般來(lái)講，進(jìn)行real-time qPCR MasterMix都是2X的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR 靈敏度高，所以每個(gè)樣品至少 要做3個(gè)平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于 Ct相差較多或者SD太大， 無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通常來(lái)講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM;模板如果是總RNA 一般是10ng-500,如果cDNA ,通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因 的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng) 驗(yàn)值，在操作過(guò)程中，還需要根據(jù)所用MasterMix ,模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個(gè)最佳反應(yīng)體

2、系。在反應(yīng)體系配置過(guò)程中，有下面幾點(diǎn)需要注意：1 . MasterMix 不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。2 .更多的配制Mix進(jìn)行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。3 .每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣！4 .所有成分加完后，離心去除氣泡。5 .每個(gè)樣品至少3個(gè)平行孔。參比或者校正染料(reference dye , passive dye )常用的是ROXTM (現(xiàn) 在已經(jīng)是ABI的注冊(cè)商標(biāo)了！)或者其他染料，只要不影響檢測(cè)PCR產(chǎn)物的熒 光值就可以。參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差， 提供一個(gè)穩(wěn)定的基線

3、?，F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把 ROXTM配制在MasterMix 或者Premixture 里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng) 優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加 ROXTM染料校正。通常來(lái)講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的 PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-150bp 之間，所以只需要變性 和退火就可以了。SYBRGreen等染料法，最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加 一個(gè)溶解程序，來(lái)形成溶解曲線，判斷 PCR產(chǎn)物的特 異性擴(kuò)增。而溶解程序， 儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個(gè)在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時(shí)候， 進(jìn)行熒光信 號(hào)的收集。3.儀器設(shè)置所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時(shí)候

4、包括反應(yīng)板設(shè)置( plate setup ) 和程序設(shè)置(program setup )。我們以 ABI StepOne 為例，詳細(xì)看一下反 應(yīng)設(shè)置：A.首先是實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進(jìn)行g(shù) 量”實(shí)驗(yàn)。B.實(shí)驗(yàn)方法的選擇：我們選用的比較 Ct的SYBR Green 方法，F(xiàn)ast 程序，以cDNA為模板進(jìn)行。C.目的基因的設(shè)置：有幾個(gè)目的基因和目的基因的名稱。D.樣品的設(shè)置：包括哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)組，哪個(gè)是對(duì)照組。以及負(fù)對(duì)照的設(shè)置和 生物重復(fù)的設(shè)置。E.對(duì)照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個(gè)是為后面的定量做準(zhǔn)備F.反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的 Maste

5、rMix 。 比如BioTeke的95 c 2分鐘就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10 分鐘)。 循環(huán)反應(yīng)是95 C15秒，60 C15秒的40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默 認(rèn)設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說(shuō)明書上建議的程序。G.反應(yīng)體系的設(shè)置:A-G這五個(gè)步驟簡(jiǎn)單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。需要注意一點(diǎn)ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX 0有些公司 是把ROX或者其他染料配制在 MasteMix里面；也有的是單獨(dú)分開。要根據(jù) 不同公司的MasterMix 進(jìn)行這一個(gè)步驟的選擇。BioTeke的MasterMix 里 沒(méi)有參比染料，所以選擇 “none”。設(shè)置好之

6、后，就可以把配置好的 PCR管放進(jìn)儀器，點(diǎn)擊RUN !五、Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析1 . Real-time qPCR常見參數(shù)基線(baseline )通常是3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線閾值(threshold )自動(dòng)設(shè)置是3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定 要用同一個(gè)閾值。Ct值:與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。Rn (Normalized

7、reporter )是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料 的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。 Rn : zRn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(ARn=Rn-基線)2 .影響Ct值的關(guān)鍵因素模板濃度模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35 之間。反應(yīng)液成分的影響任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響- 比如溶液的pH值和鹽濃度。PCR反應(yīng)的效率PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯 度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn) 曲線。PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說(shuō)來(lái)，反應(yīng)效 率在90-110% 之

8、間都是可以接受的。3 .如何評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果PCR擴(kuò)增效率：為了正確地評(píng)估 PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重 復(fù)，至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。常見問(wèn)題1 .無(wú)Ct值出現(xiàn)檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般SG法采用72 C延伸時(shí)采集，Taqman法 則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。引物或探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。2 . Ct值出現(xiàn)過(guò)晚（Ct>38 ）擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行 反應(yīng)；

9、適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。3 .標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。引物或探針不佳：重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針。模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高4 .負(fù)對(duì)照有信號(hào)引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組 DNA的引入，或通過(guò) 引物設(shè)計(jì)避

10、免非特異擴(kuò)增。5 .溶解曲線不止一個(gè)主峰引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組 DNA的引入，或通過(guò) 引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。6 .擴(kuò)增效率低反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適 度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。7 .同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增效

11、率，靈敏度，特異性如果擴(kuò)增效率在90%-110%,都是特異性擴(kuò)增，都可以把數(shù)據(jù)用于分析。8 .擴(kuò)增曲線的異常？比如 “S型曲線？參比染料設(shè)定不正確（MasterMix 不加參比染料時(shí)，選 NONE）模板的濃度太高或者降解熒光染料的降解熒光定量PCR問(wèn)題匯總1 .定量PCR儀的開關(guān)機(jī)順序是怎樣的？按照正確的開關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障 的頻率。開機(jī)順序：先開電腦，待電腦完全啟動(dòng)后再開啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開定量 PCR的收集軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號(hào)收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，最后關(guān)閉電腦2 .哪

12、些種類的反應(yīng)管和蓋子適合定量 PCR實(shí)驗(yàn)使用？有何需要注意的地方？定量PCR實(shí)驗(yàn)可以使用以下耗材：96孔光學(xué)反應(yīng)板配合光學(xué)膜，0.2 ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合光學(xué)膜，0.2 ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合平蓋的光學(xué)八聯(lián)管蓋。ABI公司生產(chǎn)的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號(hào)見下表：3 .為什么要定期對(duì)電腦進(jìn)行磁盤碎片整理？怎樣整理？當(dāng)運(yùn)行實(shí)時(shí)定量PCR儀及使用軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)算機(jī)會(huì)刪除并創(chuàng)建若干文件，計(jì)算機(jī)硬盤的空閑空間會(huì)被分割成越來(lái)越多的小塊。當(dāng)硬盤驅(qū)動(dòng)器上文件以 分解的碎片存儲(chǔ)時(shí)，程序需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能存取文件，因?yàn)楸仨毝啻?尋找文件碎片以存取不同的片斷。碎片整理實(shí)用程序?qū)⒁粋€(gè)文件分解開的多個(gè)

13、碎 片合并在一起，并存儲(chǔ)到硬盤的同一個(gè)位置，從而清除文件碎片，進(jìn)而優(yōu)化系 統(tǒng)性能。碎片整理的方法如下： 在 Windows 桌面上，選擇開始(start),我的電腦(My computer) 。 在(我的電腦)窗口中，用鼠標(biāo)右鍵單擊硬盤驅(qū)動(dòng)器，并選擇 (屬性)property 。 在(屬性)對(duì)話框中選擇工具(Tools)選項(xiàng)卡，單擊開始整理(Defragmentnow)。 單擊碎片整理(Defragment)。 當(dāng)顯示 碎片整理完畢”對(duì)話框時(shí)，單擊(確定)。 在 本地磁盤屬性”對(duì)話框中，單擊(確定)。 為計(jì)算機(jī)機(jī)中剩余的驅(qū)動(dòng)器重復(fù)如上步驟。4 . 何時(shí)執(zhí)行 windows service pa

14、ck 更新?不要執(zhí)行該操作。除非美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司代表通知您更新操作系統(tǒng)，否 則請(qǐng)不要更新控制定量PCR儀的計(jì)算機(jī)的操作系統(tǒng)。新版本的 MicrosoftWindows操作系統(tǒng)有可能與SDS軟件存在沖突，并導(dǎo)致儀器不能正常運(yùn)行。如果您希望安裝service pack （更新包）以更新操作系統(tǒng)，應(yīng)查看隨 SDS軟 件提供的版本說(shuō)明，避免兼容性問(wèn)題。5 .應(yīng)該備份哪些數(shù)據(jù)？應(yīng)該定期備份您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，備份頻率推薦每周一次，用光盤刻錄。同時(shí)您 也應(yīng)該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這些文件所在的目錄是 C:/Appliedbiosystems/SDS Docum

15、ent 。下 圖是校正文件的樣本。6 .怎么樣的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境才能保證儀器設(shè)備正常運(yùn)行？良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個(gè)方面：電源：推薦配備合適的UPS或穩(wěn)壓器。通風(fēng)：儀器的通風(fēng)應(yīng)該沒(méi)有阻擋。溫度：推薦實(shí)驗(yàn)室配備空調(diào)，溫度應(yīng)該控制在 10-30 ° C 之間。濕度：20-80% ;對(duì)于潮濕的省份，推薦實(shí)驗(yàn)室配備除濕機(jī)?？臻g：易于操作，安全。7 .怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？一個(gè)辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的 高信號(hào)，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊

16、上的前提下，執(zhí)行 ROI的校正， 當(dāng)某個(gè)孔的信號(hào)明顯高出其他孔時(shí)，則表明該孔被污染。清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個(gè)污染的反應(yīng)孔中。吹打數(shù)次。將廢液吸入廢液杯中。重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。8 .什么是背景校正？多長(zhǎng)時(shí)間執(zhí)行一次背景校正？背景校正程序測(cè)量定量PCR儀所使用的反應(yīng)管和水的空白熒光強(qiáng)度。在運(yùn)行校正程序期間，定量PCR儀在10分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強(qiáng)度，信號(hào)收 集的溫度為60。C。隨后，SDS軟件計(jì)算所收集到的熒光強(qiáng)度的平均值， 提取結(jié)果并保存到校正文件中。軟件在今后的分析中將自動(dòng)調(diào)用此校正文件， 從 實(shí)驗(yàn)數(shù)

17、 據(jù)中扣除背景信號(hào)。因?yàn)楸尘盁晒獾男盘?hào)強(qiáng)度隨著許多外界因素（比如外來(lái)的污染、反應(yīng)板 /反 應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進(jìn)行背景校正，一般 每三個(gè)月到半年校正一次。9 .什么是純熒光校正？多長(zhǎng)時(shí)間校正一次？純熒光校正是測(cè)定各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的波長(zhǎng)和信號(hào)強(qiáng)度，通俗地說(shuō)是讓儀器 認(rèn)識(shí)”各種熒光染料。軟件收集并儲(chǔ)存各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信息。以后每次定量實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過(guò)程中，SDS軟件收集樣品的原始光譜信號(hào)，并將此原 始光譜與純熒光文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較， 精確扣除不同染料的信號(hào)重疊部分，從 而確定樣 品中的熒光染料種類和信號(hào)強(qiáng)度。推薦每半年進(jìn)行一次純熒光校正。在運(yùn)行光譜校正之前

18、，請(qǐng)先進(jìn)行背景校正 和ROI校正。10 .96孔板怎樣封膜？當(dāng)使用96孔板做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，推薦使用光學(xué)膜代替蓋子來(lái)密封反應(yīng)孔。 正 確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然后橫向，最后沿著板的邊緣按 壓使之密封。11 .使用單管或8連管做實(shí)驗(yàn)時(shí)，在樣品加熱塊上應(yīng)該怎樣安排放置?使用單管或8連管做實(shí)驗(yàn)，并且樣本數(shù)量不多的時(shí)候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對(duì)稱地安放樣品，最好是縱向放置，并且優(yōu)先放在第 6列或第7歹I, 然后 逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來(lái)的時(shí)候不至于發(fā)生傾斜，各 個(gè)反應(yīng)管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性.12 .絕對(duì)定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別？絕對(duì)定

19、量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝 數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。舉例來(lái)說(shuō)，如果研究項(xiàng)目中包括處理過(guò)的和未經(jīng)處理的對(duì)照樣本，通常可以將未經(jīng)處理的樣本指定為基準(zhǔn)，規(guī)定其目的基因濃度為100% ,將經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果除以對(duì)照樣品的定量結(jié)果，就可以計(jì)算各個(gè)處理樣本的基因含量相 對(duì)于未處理樣品的百分比。絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線 法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可

20、以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作 上更為簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中 DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列 梯度稀釋。CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比的數(shù)學(xué)關(guān)系，來(lái) 計(jì)算不同樣本之間的相對(duì)百分比，其計(jì)算公式是。絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)易于理解，但是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測(cè)定其 DNA含量比較 困難。有許多商業(yè)性的標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒供選購(gòu)，可以解決這種困難。相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品容易在實(shí)驗(yàn)室里自己制備， 但是數(shù)據(jù)處理比較麻煩，對(duì)實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)的解釋有一定難度。13 .定量PCR基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？總的來(lái)說(shuō)，有三個(gè)層次

21、的校正是必須要做的。首先，參比信號(hào)校正。試劑中必須包含固定濃度的 ROX ,這樣由于反應(yīng)總 體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所 引起的熒光信號(hào)波動(dòng)都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR進(jìn)程。ROX校正能 夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。其次，內(nèi)對(duì)照校正。實(shí)驗(yàn)中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來(lái)自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實(shí)驗(yàn)結(jié)果校正到每個(gè)細(xì)胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2 ）的同時(shí)定量一個(gè)內(nèi)對(duì)照基因（如18S RNA 基因），然后IL-2/18S。內(nèi)對(duì)照校正使不同樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以相互比較。第三

22、,計(jì)算相對(duì)于基準(zhǔn)樣品（Calibrator）的相對(duì)基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時(shí)和6小時(shí)的、正常和患病的之間的基因表達(dá)的差別，則需要計(jì)算處理/未處理、6小時(shí)/0小時(shí)、患病/正常。14 .標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么處理？假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后 0、24、48小時(shí)IL-2 基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用的內(nèi)對(duì)照是 18S RNA 基因。IL-2和18S RNA的測(cè)定結(jié)果都是總RNA的pg數(shù)，數(shù)據(jù)的處理方法見下表：15 .什么是CT值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比：如果（1）不同管之間的PCR反應(yīng)效率相同；（2）這些PCR的反應(yīng)效率接近100%

23、 ,可以從上面的公式推出相對(duì)含量（X01/X02）=2 -6 6。CT設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時(shí)IL-2 基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用內(nèi)又1照是18S RNA 基因。IL-2 和18S RNA 的測(cè)定結(jié)果都是CT 值，而沒(méi)有通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總 RNA的pg數(shù)16 .每個(gè)反應(yīng)管中可以加入多少種探針?每個(gè)反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目， 取決于儀器、軟件、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等 幾個(gè)方面。首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下， 全波長(zhǎng)檢測(cè)的定量PCR儀如激光管-CCD類型對(duì)于探針的數(shù)量實(shí)際上是沒(méi)有限 制 的。如果信號(hào)的采集要通過(guò)濾色片，那么探針的數(shù)量取

24、決于濾色片的數(shù)目， 增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動(dòng)儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。以AB公司的儀 器為 例，7900 和7700 是激光-全波長(zhǎng)檢測(cè)的，7000、7300 是4色濾 色片的，7500 是5色濾色片的。其次是化學(xué)上的可能性。不同的熒光基團(tuán)要組合到一起，在同一反應(yīng)管內(nèi)使 用，必須其激發(fā)波長(zhǎng)既相對(duì)靠近又不能靠得太近，既保證信號(hào)激發(fā)的效率又保證 信號(hào)不 重疊干擾，能夠區(qū)分清楚?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團(tuán)種類有限，滿足這樣條 件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達(dá)到每組 4到5種熒光的水平。第三是實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和選用的探針類型。定量PCR實(shí)驗(yàn)必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(tuán)(TAMRA)也要占用一種 熒 光，對(duì)于4色檢測(cè)的儀器來(lái)說(shuō)，只剩下2種熒光可以標(biāo)記探針，對(duì)于5色檢測(cè) 的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用 TaqMan MGB 探針，由于它 的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標(biāo)記探針。 如果實(shí)驗(yàn)要求不高，不做 ROX校正(AB公司不推薦這樣 做)，還可以再多 一種熒光用于標(biāo)記探針。第四是研究應(yīng)用本身的要求。如果研究 SNP和基因突變，因?yàn)榻^大多數(shù)人 類基因是2態(tài)的，只存在兩種等位基因，2條探針已經(jīng)足夠。如果研究基因表 達(dá)，通常是