蛋白純化AKTA操作說明#

1、AKTA pure 操作說明分子篩層析操作步驟：1. 開機(jī)：打開 AKTA pure 開關(guān)，看指示燈，泵同步（泵內(nèi)有注入液體的聲音） 。2. 打開系統(tǒng)： 打開電腦：雙擊 Unicorn 7.0 打開系統(tǒng)，進(jìn)入 log on 界面，用戶名默認(rèn)為 Default ，輸 入密碼： default ，點(diǎn) ok 鍵，出現(xiàn)提示對話框，繼續(xù)點(diǎn)確定，進(jìn)入系統(tǒng)。注意：進(jìn)入系 統(tǒng) 時(shí)會(huì)彈出 三個(gè)界 面： System Control 界面， Evaluation 界面 和 Administration 界面。其中 system Control 界面為主操作窗口，所有的設(shè)置選項(xiàng)都是在 該界面下完成： Manual-

2、Execute Manual instructions- ； Evaluation 界面為結(jié)果數(shù) 據(jù)查看及處理窗口； Administration 界面為 Unicorn 7.0 系統(tǒng)設(shè)置界面。3. 洗泵：把 A1 泵頭從 20% 乙醇中取出，用去離子水沖洗，放入分子篩緩沖液中，在SystemControl 界面下，點(diǎn)擊 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash- 點(diǎn) 開 inlet ，選擇 A1-Excuse 。4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)： 設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置柱壓

3、 -Execute ； 設(shè)流速： Pumps-System flow - 設(shè)置 system flow （1mL/min ） -Execute 。 注意：流速和柱壓設(shè)置參照“ GE蛋白純化柱表”，不要超出最高限制。5. 裝柱子（先上后下 ）：接柱子的上面：擰下連接進(jìn)樣閥和檢測器之間的線，等進(jìn)樣閥出口有液體流出時(shí)，擰開柱上面線頭的螺帽，將它連到進(jìn)樣閥出口； 接柱子的下面：去掉柱下端連接的注射器，連上接頭，連上一段線，待液體滴出滴出液 體滴到檢測器上的連接口的洞里， 滴滿，將接頭連到檢測器的連接口里。6. 平衡柱子：分子篩 buffer 平衡柱子，一般要兩個(gè)小時(shí)左右，鹽離子濃度達(dá)到5.5% 左右。

4、7. 設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命 名：先 en d-Ma nual in struct ions，點(diǎn)擊 browse，彈出 select result n ame&l ocati on 界 面，點(diǎn)開文件夾“ defaultHome ”，找到文件夾“l(fā)abdata”，點(diǎn)開，選擇自己名字 首字母縮寫文件夾（已創(chuàng)建），在界面下方“ name”指令框進(jìn)行命名。注意： 命名時(shí)要標(biāo)明 日期 ， 柱子型號 ， 樣品名稱 。 設(shè)流速： Pumps-System flow- 設(shè)流速（ 1 mL/min ）-Execute； 設(shè)柱壓： Alams- alam systerm pressure-high ala

5、m- 設(shè)置柱壓 -點(diǎn)擊 Execute； 洗 A 泵：Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開 in let，選擇 A1-Excuse ； 紫外調(diào)零： Monitors-Auto zero UV-Execute ；設(shè)置收集體積： Fracton collection-peak fractionation-fraction size-設(shè)置收集體積 - Execute；一般設(shè)為1 mL（可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整）。設(shè)置收集水平： Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level- 設(shè)置起始 收集水平 - Execute 。注意： 對

6、于初次純化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可設(shè)低些， 如 10 mAU, 避免損失蛋白。8. 上樣：沖洗 Loop 環(huán)：取 5mL 注射器，吸取 5 mL 分子篩（不能有氣泡） ，從進(jìn)樣口注射 2 倍 Loop 體積的分子篩來清洗 Loop 環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白樣品（ < 2 mL）, 12000 rpm離心3 min，把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管管，重復(fù)一次，以去除沉淀，避免堵塞系統(tǒng)；手動(dòng)蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop 環(huán)內(nèi)；注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作， 首先彈出注射器內(nèi)的氣泡， 隨后稍推注射器， 使注射器出口處懸掛一樣品液滴（別太用力，導(dǎo)致液滴滴落），

7、然后把注射器插入進(jìn)樣口，把蛋白樣品推入 Loop 環(huán)中。Inject:點(diǎn)擊 Flow path-injection valve- 點(diǎn)開 position 選項(xiàng)-inject-Execute- 走 2 倍 Loop 體積的分子篩緩沖液；Load: 點(diǎn)擊 Flow path-injection valve- 點(diǎn)開 position 選項(xiàng) -manual load-Execute ，調(diào)回 Load 狀態(tài)。9. 收集目標(biāo)蛋白：參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線， 估計(jì)樣品出峰位置， 收集蛋白樣品， 做好標(biāo)記，過完后， peak fracstop 900 停止收集。10. 20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出來，離子濃度平衡

8、后，點(diǎn)擊pause,進(jìn)分子篩的buffer的泵頭用去離子水洗，放入 20%的乙醇中， continue-洗泵（ A1 泵），平衡柱子。 20%的乙醇平衡柱子， 一般要兩小時(shí)左右,鹽離子濃度達(dá)到 0%。11. 收柱子（先下后上） ：調(diào)節(jié)流速至 0.5 mL/min ,擰下柱下面的接頭,連上注射器,再調(diào)流速至 1 mL/min ,注 射器內(nèi)吸入 3-5 mL 20%乙醇,取下柱上面的接頭看是不是往外流液體,因?yàn)樽⑸淦鲀?nèi) 有壓力,液體會(huì)倒流,蓋子內(nèi)滴滿液體,立即擰上蓋子,防止進(jìn)氣泡,將進(jìn)樣閥的線接 到檢測器上。12. 關(guān)閉系統(tǒng)：點(diǎn)擊 End 關(guān)閉系統(tǒng)界面,關(guān)閉 AKTA pure 電源,關(guān)電腦。20

9、18-09-01AKTA pure 操作說明離子交換蛋白純化步驟（ RESOURCE Q/S ）1. 開機(jī)：打開 AKTA pure 開關(guān)，看指示燈，泵同步（泵內(nèi)有注入液體的聲音） 。2. 打開系統(tǒng)：打開電腦：雙擊 Unicorn 7.0 打開系統(tǒng) ,進(jìn)入 log on 界面，用戶名默認(rèn)為 Default, 輸入密 碼： default, 點(diǎn) ok 鍵，出現(xiàn)提示對話框，繼續(xù)點(diǎn)確定，進(jìn)入系統(tǒng)。注意：進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)會(huì)彈出三個(gè)界面： System Control 界面 , Evaluation 界面和 Administration 界面。其中 system Control 界面為主操作窗口，所有的設(shè)置選

10、項(xiàng)都是在該界面下完成： Manual-Execute Manual instructions- ； Evaluation 界面為結(jié)果數(shù)據(jù)查看及處理窗口； Administration 界面為 Unicorn 7.0 系統(tǒng)設(shè)置界面。3. 洗泵：點(diǎn)擊pause暫停系統(tǒng)-去離子水沖洗 A1,B1進(jìn)液泵頭-分別放入A , B液中；洗 B 泵： 選擇 System Con trol 界面 manu al-Execute Man ual in struct ion s-Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開 inlet,選擇 B1-Excuse ；洗 A 泵： 選擇 System Con trol 界面

11、 manu al-Execute Man ual in struct ion s-Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開 in let,選擇 A1-Excuse,洗泵結(jié)束后調(diào) B 至 100%，0mi n-Execute。4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置最高柱壓 -Execute 。 設(shè)流速： Pumps-System flow- 設(shè)置 system flow （1 mL/min ）-execute ； 注意： 流速和柱壓設(shè)置參照“ GE 蛋白純化柱表” ,不要超出最高限制。5. 安裝 RESOURCE 柱（先上

12、后下）：裝離子柱時(shí)先擰開離子柱上面, 連上來自進(jìn)樣閥的線, 邊擰緊上面邊擰松柱下面, 在離 子柱子下端出口連上轉(zhuǎn)接頭, 接上一根較短的先并連到檢測器上 （流出液體, 滴滿檢測 器上的連接口的洞里,再擰緊） 。6. 平衡 RESOURCE 柱：等 B 液平衡后，點(diǎn)擊 Pumps-gradient-Target-調(diào) B 至 0%，0min-Execute。等平衡后， 記錄最高和最低鹽離子濃度：離子交換 B 液鹽離子濃度約為 84%,離子交換 A 液鹽離 子濃度約為 1.7%。7. 設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命 名：先 en d-Ma nual in struct ions，點(diǎn)擊 browse，彈出 se

13、lect result n ame&l ocati on 界面， 點(diǎn)開文件夾"defaultHome ”，找到文件夾"labdata”，點(diǎn)開，選擇自己名字首字 母縮寫文件夾（已創(chuàng)建），在界面下方"name”指令框進(jìn)行命名。注意： 命名時(shí)要標(biāo)明 日期 ， 柱子型號 ， 樣品名稱 。設(shè)流速： Pumps-System flow- 設(shè)流速（ 1 mL/min ） -Execute;設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置柱壓 - 點(diǎn)擊 Execute； 紫外調(diào)零： Monitors-Auto zero UV-E

14、xecute ；設(shè)置收集體積： Fracton collection-peak fractionation-fraction size- 設(shè)置收集體積 - Execute； 一般設(shè)為 1 mL （可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整 ） 。設(shè)置收集水平： Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level- 設(shè)置起始 收集水平 - Execute 。注意： 對于初次純化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可設(shè)低些， 如 10 mAU ，避免損失蛋白。8. 上樣：沖洗 Loop 環(huán)：取 5 mL 注射器，吸取 5 mL 分子篩（不能有氣泡） ，從

15、進(jìn)樣口注射 2 倍 Loop 體積的分子篩來清洗 Loop 環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白樣品（ 2 mL）, 12000 rpm離心3 min，把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管管，重復(fù)一次，以去除沉淀，避免堵塞系統(tǒng)；手動(dòng)蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop 環(huán)內(nèi)；注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作， 首先彈出注射器內(nèi)的氣泡， 隨后稍推注射器， 使注射器出口處懸掛一樣品液滴（別太用力，導(dǎo)致液滴滴落），然后把注射器插入進(jìn)樣口，把蛋白樣品推入 Loop 環(huán)中。Inject: 點(diǎn)擊 Flow path-injection valve- 點(diǎn)開 position 選項(xiàng) -inject-execute-

16、 走 2 倍 Loop 體積的分子篩緩沖液；Load: 等流穿峰出來后，點(diǎn)擊 Flow path-injection valve- 點(diǎn)開 position 選項(xiàng)-manual load-Execute ，調(diào)回 Load 狀態(tài)。注意： 流穿峰蛋白先別丟棄，它有可能是樣品沒有掛上柱子而直接流出來的目標(biāo)蛋白。9. 洗脫目的蛋白：Pumps-Gradient target 50% , length 50 min （可調(diào)）-Execute，自離子柱上洗脫結(jié)合的 蛋白10. 收集目標(biāo)蛋白：收集洗脫下來的蛋白樣品，做好標(biāo)記，過完后，peak fracstop 900停止收集。11. B 液平衡離子柱：Pumps-Gradient target 50% ， length 0 min- Execute ，至鹽離子濃度達(dá)到最高且平衡。如繼續(xù)純化其他蛋白樣品 ：要用 A 液再平衡后再上樣，步驟同上1-11。如不再純化其他蛋白樣品 ：點(diǎn)擊pause暫停系統(tǒng)-去離子水沖洗 A1,B1進(jìn)液泵頭，放入 20%的乙醇中，