從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌

1、從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽胞桿菌微生物學(xué)設(shè)計性實驗報告實驗項目名稱，從壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽抱桿菌，成員專業(yè)，班級指導(dǎo)教師,，從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽抱桿菌 一、實驗?zāi)康?、通過本實驗的學(xué)習(xí)，學(xué)習(xí)掌握從環(huán)境中分離產(chǎn)淀粉酶菌株以及菌株初步鑒定的方法；2、鞏固微生物分離純化、細菌生理生化鑒定、染色觀察等實驗技能，對所學(xué)習(xí)過的微生物學(xué)實驗方法進行綜合技能訓(xùn)練；3、培養(yǎng)綜合利用微生物學(xué)、生物化學(xué)等相關(guān)知識，自行設(shè)計、實施并判斷實驗結(jié)果的能力。4、要求根據(jù)所學(xué)知識自主設(shè)計實驗方案，在實驗方案通過審核后組織實施， 最終要求獲得產(chǎn)淀粉酶的菌株并對其進行初步的鑒定。二、實驗材料1、土壤樣品實驗前一周在距土壤表層5

2、-8厘米左右處填埋饅頭，實驗前一天用塑料袋在預(yù) 埋處取樣O 辰關(guān)宜2、 A 口仆是富集培養(yǎng)基，即16g的可溶性淀粉，蛋白陳5g, NaCl 5g;選擇性培養(yǎng)基，即可 溶性淀粉16克，蛋白陳5g, NaCl 5克，瓊脂20克，葡萄糖6克(培養(yǎng)及含量均 為每升)。3、試劑草酸錢結(jié)晶紫染液，95K醇，番紅水溶液、盧戈氏碘液4、玻璃器皿燒杯(500ml) 1錐形瓶(250ml) 1培養(yǎng)皿18涂布棒1移液管(1ml) 8蓋玻片，載玻片若干試管105、其他設(shè)備及儀器pH試紙，棉花，牛皮紙，玻璃珠，超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽滅菌鍋、水浴鍋、顯微鏡、接種環(huán)等三、實驗原理1、土壤中含有各種微生

3、物，其中產(chǎn)淀粉酶的芽抱桿菌含量在不同土壤中含量也不同，因此實驗前進行預(yù)埋工作，能使土壤中產(chǎn)淀粉酶的細菌含量增加。待實驗前取樣即可。2、在只用淀粉充當(dāng)碳源的選擇培養(yǎng)基中，只有能產(chǎn)生淀粉酶利用淀粉的菌體 能成為優(yōu)勢菌種。在淀粉選擇培養(yǎng)基中，產(chǎn)淀粉酶的菌種可以得到富集及分離。3、芽抱是菌體生長到一定階段形成的一種抗逆性很強的休眠體結(jié)構(gòu)，芽抱最 主要的特點就是抗性強，對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學(xué)物質(zhì)都有很強的抗性。它幫助菌體度過不良環(huán)境，在適宜的條件下可以重新轉(zhuǎn)變成為營 養(yǎng)態(tài)細胞。細菌富集一段時間后，生長環(huán)境不利，會產(chǎn)，生芽抱，再在80-90溫度下殺死菌體，可使芽抱得到富集。C4、菌

4、體可經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下被判斷出是否為芽抱桿菌。5、在含有淀粉的鑒別培養(yǎng)基的平板上，具有產(chǎn)淀粉酶能力的芽抱桿菌，水解 淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周圍出現(xiàn)水解圈，但肉眼不易分 辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈藍色，水解圈無色。四、實驗步驟1（樣本采集在預(yù)埋處采取土樣用塑料袋裝好，不要損壞土壤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。2（目的菌株的富集?取12.5g 土壤加入250ml燒杯中，再加入112ml去離子水制成土壤混懸液， 加入一小層玻璃珠。在錐形瓶中加入 2g的可溶性淀粉，蛋白陳0.625g, NaCl 0.625g,調(diào)節(jié)pH值為7.0-7.2。在37攝氏度搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，使菌體富集 且產(chǎn)生

5、大量芽抱。?在85?-90?水浴鍋中加熱10分鐘，殺滅菌體，使芽抱得到富集。3.選擇性分離,1,3,4,5,61010101010 ? 將菌液上清分別稀釋成、，分別取菌液 0.2ml 均勻涂布在十個含葡萄糖的淀粉培養(yǎng)基上，在 37攝氏度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天，平 板培養(yǎng)基表面便形成了若干分散的單菌落。4、制片檢測?取其中平板培養(yǎng)基表面形成了若干分散的單菌落的平板，用盧戈氏碘液檢測，根據(jù)有無淀粉水解圈來判斷具有產(chǎn)淀粉酶能力，觀察水解圈大小及菌落特征。?挑取對照板中菌落特征相同的菌落點，通過革蘭氏染色制片觀察，判別所選菌落是否為芽抱桿菌。5、純培養(yǎng)取其中是芽抱桿菌的相應(yīng)菌點種落接到淀粉平板上純培養(yǎng)，在37

6、攝氏度培養(yǎng)1天（每一種菌接點兩處進行對照）。6、培養(yǎng)后觀察各菌落形態(tài)特征取其中一塊板分別滴加魯戈氏碘液，觀察淀粉水解圈大小，挑取對照板中的菌落通過簡單染色制片觀察，判別所選菌落是否為芽抱桿菌。7、保藏菌種斜面淀粉培養(yǎng)基的試管上標(biāo)上菌株名稱和接種日期后進行接種，待菌種在?左右的冰箱中保藏。 生長完全后，至于4五、時間安排6日上午：取樣6日下午：富集培養(yǎng)，配制培養(yǎng)基并滅菌（另包括培養(yǎng)皿，移液管，試管等），倒 平板，配制保藏菌種的培養(yǎng)基8日下午：殺死菌體，稀釋菌液，接種芽抱9日下午：檢測，染色制片觀察，點種轉(zhuǎn)接10日下午：檢驗所選菌種并保藏六、實驗結(jié)果1、稀釋后接種芽抱的平板上長出分散的單菌落，滴加

7、碘液后有變色圈，其菌落特征為扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙有褶皺。2、顯微圖片一株為桿狀，細長，中間或近似中間部位有芽抱，一株為球狀，雙生，均為革蘭氏陽性。,410此為的平板上的菌，24h后菌落直徑為9mm變色圈半徑/菌落半徑=1.43,310此為的平板上的菌，菌落極小，無法觀察形態(tài)，但是變?nèi)艽?、點種后的菌落形態(tài)扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙有褶皺，有水解 圈，滴加碘液后有變色圈4、最終得到兩株兩株目的菌株。七、分析或討論,1、殺滅菌體時，溫度控制不夠好。溫度應(yīng)該是 80-9010分鐘，可當(dāng)時我C,左右便把菌懸液放入到了水浴鍋中，但是實際上，剛形成的芽抱總們是在70C是處于休眠狀態(tài)。熱

8、處理（如65?放置幾十分鐘）可以使芽抱加速活化，提前放入水浴鍋中可能使一部分芽抱剛剛萌發(fā)便被殺死，造成菌懸液中的芽抱數(shù)量減或者，一部分芽抱直接被殺死。少，,2,21010 2、接種時跳過的濃度，濃度選擇不夠合理。稀釋菌懸液時，跳過的,1,31010濃度，但是實驗結(jié)果是，的平板上菌落太多，不能準(zhǔn)確觀察，的平板 上,210菌落偏少，是最好的濃度。下次實驗時應(yīng)該注意在不能準(zhǔn)確定接種的情況 下應(yīng)該多接種幾組，不能怕麻煩。3、培養(yǎng)基中加入葡萄量頗多，導(dǎo)致細菌利用較多利用葡萄糖，產(chǎn)生的淀粉水 解圈不明顯。培養(yǎng)基中加入葡萄糖，原因是芽抱萌發(fā)時加葡萄糖以利生長，但是可 能是當(dāng)時加入葡萄糖的量偏多，使不能利用淀粉的細菌芽抱也萌發(fā)，致使有較多雜 菌不利于檢驗，同時又使可利用淀粉的細菌芽胞萌發(fā)成營養(yǎng)細胞后利用葡萄糖，而 不是利用淀粉，致使產(chǎn)生的淀粉水解圈太小。下次實驗時應(yīng)注意仔細查閱資料及詢 問老師