反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定Ewing肉瘤患者骨髓微小殘留病變

1、    反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定Ewing肉瘤患者 骨髓微小殘留病變        【摘要】目的建立以EWS-FLI-1融合基因為標(biāo)志，用反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測定骨髓Ewing肉瘤細胞的體系。方法用RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)Ewing肉瘤T1細胞系，將其與正常人骨髓單個核細胞按比例混合，使T1細胞濃度依次為100%，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，0，提取總RNA，合成cDNA，PCR擴增EWS-FLI-1；同時選擇5例骨髓轉(zhuǎn)移的Ewing

2、肉瘤患者，測定診斷時及緩解后骨髓EWS-FLI-1融合基因。結(jié)果T1細胞濃度為100%，10-310-6時，EWS-FLI-1均陽性；10-7及0時陰性。5例患者診斷時骨髓EWS-FLI-1均陽性，完全緩解后2例轉(zhuǎn)陰。結(jié)論以EWS-FLI-1融合基因為標(biāo)志的反向PCR測定骨髓Ewing肉瘤細胞的靈敏度為10-6，它是測定骨髓Ewing肉瘤細胞高度敏感的方法；Ewing肉瘤患者完全緩解時，部分患者骨髓仍存在腫瘤細胞。【主題詞】Ewing 氏肉瘤；骨髓；聚合酶鏈反應(yīng)Minimal residual disease in bone marrow in patients with Ewings sar

3、coma detected by RT-PCR amplification of EWS-FLI-1 fusion gene transcriptTANG Suoqin, HUANG Dongsheng, ZHANG Xiaofei.（ Department of Pediatrics, PLA General Hospital, Beijing 100853, China）【Abstract】ObjectiveTo set up a system for sensitively detecting minimal Ewings sarcoma cells in bone marrow. Me

4、thodsEwings sarcoma cell line T1 cells were serially diluted with normal bone marrow cells so that the concentration of tumor cells was 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, and 0, respectively. Total RNA was isolated from these samples and cDNA was synthesized. EWS-FLI-1, a fusion gene formed due to chromo

5、some translocation, was amplified with PCR. Bone marrow samples from five patients with Ewings sarcoma patients with tumor metastasis were examined for EWS-FLI-1 transcript.ResultsT1 cells could be detected when one was present in 106 normal bone marrow cells. Thus the sensitivity of detection was 1

6、0-6. A 434 bp EWS-FLI-1 transcript was detected in five Ewings sarcoma patients examined at the time of diagnosis. After complete remission, EWS-FLI-1 was still positive on RT-PCR in 3 patients, although BM pathological examination was negative in all cases. ConclusionRT-PCR for EWS-FLI-1 is sensiti

7、ve enough to detect minimal residual Ewings sarcoma cells in the bone marrow. It can identify residual tumor cells in pathologically negative bone marrow specimens. 【Subject words】Ewings sarcoma; Bone marrow; Polymerase chain reactionEwing肉瘤為兒童常見的骨骼組織惡性腫瘤，它可轉(zhuǎn)移至骨髓，檢測骨髓微量Ewing肉瘤細胞（稱微小殘留病變，MRD）對判斷病情及對治

8、療的反應(yīng)具有重要意義。我們建立反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測定骨髓微量Ewing肉瘤細胞的體系，并測定Ewing肉瘤患者骨髓MRD。材料與方法1.Ewing肉瘤細胞系T1細胞：細胞由美國洛杉磯兒童醫(yī)院Siegel教授惠贈，此細胞含t（11，22）（q24，q12）。T1細胞用RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，5% CO2，3 d換液1次。2.靈敏度試驗：取正常人骨髓5 ml，淋巴細胞分層液分離單個核細胞，與T1細胞按比例混合，使T1細胞濃度依次為10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，100% T1細胞及100%正常人骨髓分別做陽性及陰性對照，反向PCR檢測上述7個標(biāo)本中EWS-FLI-

9、1融合基因。3.臨床資料：患者5例，年齡11.2±1.3歲。男4例，女1例。原發(fā)部位髂骨2例，股骨1例，肱骨1例，腓骨1例。診斷時組織學(xué)檢查骨髓均受累，腫瘤細胞比例1.5%5%。確診后取骨髓1 ml，分離單個核細胞，PCR檢測MRD。患者采用手術(shù)、放療、化療（長春新堿1.5 mg/m2+環(huán)磷酰胺500 mg/m2，每周1次）進行治療，緩解后復(fù)查骨髓涂片及骨髓MRD，骨髓穿刺部位均為髂后上棘，兩次穿刺為同側(cè)。4.MRD檢測：采用反向PCR，總RNA提取采用氰化物-酚-氯仿法1，cDNA采用藥盒合成(BRL產(chǎn)品)，簡述如下：Oligo（dt）12-18 1 l，總RNA 1 l，5倍首鏈

10、緩沖液4 l，0.1 mol/L DTT 2 l，DNTP(每種10 mmol/L) 1 l，逆轉(zhuǎn)錄酶（PE產(chǎn)品）1 l及DEPC處理水，總?cè)莘e20 l，42 1 h，然后95 5 min終止反應(yīng)。根據(jù)文獻報道的序列合成PCR引物2，11.3 5ACT CCC CGT TGG TCC CCT CC-3；22.3 5- TCC TAC AGC CAA GCT CCA AGT TC-3。PCR體系50 l，組成為：10倍緩沖液5 l，cDNA 8 l，引物各1 l（20 pmole/l），Taq DNA聚合酶0.25 l(PE產(chǎn)品)，DEPC處理水34.75 l。PCR條件：94，30 s，65，

11、1 min，72，2 min，30次循環(huán)。取PCR產(chǎn)物15 l，在1.5%瓊脂糖膠上電泳，EB染色，觀察結(jié)果，照相。結(jié)果1.靈敏度實驗：EWS-FLI-1融合基因為434 bp的片段；電泳結(jié)果顯示當(dāng)T1細胞濃度為100%，10-3，10-4，10-5，10-6時，均可看到434 bp的片段；而T1細胞濃度為10-7時，無任何條帶，正常骨髓亦未見到陽性條帶。表明RT-PCR檢測骨髓Ewing肉瘤細胞的靈敏度為10-6，即100萬個骨髓細胞中有一個Ewing肉瘤細胞時即可檢測出。2.PCR電泳結(jié)果：5例Ewing肉瘤患者確診時，骨髓均可見到大小為434 bp的片段，未見其他片段，表明EWS-FLI

12、-1均陽性?；颊咧委熀?3個月完全緩解，緩解后組織學(xué)檢測骨髓均未發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞，反向PCR檢測3例仍可見434 bp的條帶，但另外2例未見任何條帶。討論Ewing肉瘤起源于骨組織，分化差，常見部位是四肢，可發(fā)生于盆腔、胸壁、脊柱、頭頸部，常轉(zhuǎn)移至肺、骨及骨髓3。近年來自體骨髓移植已越來越多的用于Ewing肉瘤的治療。骨髓微小殘留病變的測定對自體骨髓移植具有重要意義，因為自體移植有將腫瘤細胞重新植入導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的可能，如果選擇治療至骨髓微小殘留病變陰性時，再行移植有可能減少移植后復(fù)發(fā)率。傳統(tǒng)上骨髓組織學(xué)檢查Ewing肉瘤細胞的靈敏度較低，約為1%，需探索新的方法。近年來PCR由于靈敏度高，在白血病

13、患者骨髓MRD測定中得到了應(yīng)用。PCR測定MRD時所測定的腫瘤細胞需有較特異的腫瘤標(biāo)志。在Ewing肉瘤，用傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)方法檢測時，85%患者存在t（11，22）（q24；q12）4，這種移位，使22號染色體上的EWS基因和11號染色體上的FLI-1基因連接在一起，形成融合基因，此融合基因有很高水平的表達。t（11，22）（q24；q12）對Ewing肉瘤和原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤（PNET）是特異性的，其他腫瘤很少出現(xiàn)5。PNET在起源上與Ewing肉瘤相似，其生物學(xué)特性、治療非常相近，故EWS-FLI-1可作為理想的腫瘤分子標(biāo)志，用來測定微量Ewing肉瘤細胞6。隨著EWS和FLI-1基因

14、各自切點的不同，形成PCR產(chǎn)物，除434 bp外，還可能形成介于300700 bp間其他的PCR產(chǎn)物。本組患者均為434 bp，反映了大部分患者EWS和FLI-1酶切位點相似的規(guī)律。PCR敏感性較高，本組測定以EWS-FLI-1為指標(biāo)的反向PCR的靈敏度為10-6。每次實驗時設(shè)陰性對照及陽性對照可較好地避免假陽性及假陰性。5例Ewing肉瘤患者確診時骨髓均有侵犯，結(jié)果EWS-FLI-1均陽性，說明RT-PCR的敏感性為100%。本研究在預(yù)實驗時同時測定了5例特發(fā)性血小板減少性紫癜患者骨髓EWS-FLI-1，結(jié)果均陰性，說明其特異性為100%。5例Ewing肉瘤確診時用PCR測定骨髓MRD均陽性

15、，與組織學(xué)檢測結(jié)果一致。完全緩解后組織學(xué)檢測腫瘤細胞陰性，而反向PCR測定3例仍陽性，提示放療、化療未能徹底清除骨髓轉(zhuǎn)移，需進一步治療。對PCR測定Ewing肉瘤骨髓MRD的臨床意義需進一步觀察、評估。本研究結(jié)果提示，以EWS-FLI-1為標(biāo)志的反向PCR對診斷Ewing肉瘤患者骨髓微量轉(zhuǎn)移有意義，EWS-FLI-1也可作為判斷療效的重要依據(jù)之一。作者單位：唐鎖勤（北京解放軍總醫(yī)院小兒內(nèi)科，100853）黃東生（北京解放軍總醫(yī)院小兒內(nèi)科，100853）張曉飛（北京解放軍總醫(yī)院小兒內(nèi)科，100853）參考文獻：1Chomczynski P, Sacchi N. Single step metho

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17、 EA, et al. Ewings sarcoma metastatic at diagnosis, results and comparisons of two intergroup Ewings sarcoma studies. Cancer, 1990,66:887-891.4Stephenson CF, Bridge JA,Sandberg AA. Cytogenetic and pathologic aspects of Ewings sarcoma and neuroectodermal tumors. Human Pathol, 1992,23:1270-1276. 5Dehner LP. Neuroepithelioma (primitive neuroectodermal tumor), and Ewings sarcom