烏拉甘草有效成分對(duì)人體４ 種腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響

1、烏拉甘草有效成分對(duì)人體 種腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響    Tags：烏拉 增殖 甘草 作者：馬淼 周旭莉 戶元林 肖輝 李學(xué)禹【摘要】 目的測(cè)定烏拉甘草提取物對(duì)人體 種腫瘤細(xì)胞的抑制效果。方法應(yīng)用 法測(cè)定甘草水提物（甘草酸）與醇提物（總黃酮）對(duì)宮頸癌細(xì)胞株（）、乳腺癌細(xì)胞株（ ）、胃癌細(xì)胞株（ ）以及肝癌細(xì)胞株（ ）增殖的抑制作用；運(yùn)用 熒光染色劑測(cè)試其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果甘草酸的抑瘤效果表現(xiàn)出濃度依賴性，與濃度呈正相關(guān)關(guān)系。高濃度甘草酸（ ）對(duì) ， 的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，其抑制率分別為，對(duì) 細(xì)胞增殖的抑制作用較差，抑制率僅為。在一定濃度范

2、圍內(nèi)（ ），其對(duì) 種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率與樣本濃度大小呈負(fù)相關(guān)關(guān)系， 劑量的甘草黃酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果最佳，其對(duì) ， ， 等 種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率分別為，以及。甘草酸、甘草黃酮均能有效誘導(dǎo)這 種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論甘草酸和甘草黃酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要途徑。 【關(guān)鍵詞】 烏拉甘草 甘草酸 酮 抗腫瘤 細(xì)胞凋亡Abstract:Objective Glycyrrhiza uralensis （ ：， ： ， ： ： ） Methods ， Results ， （ ） ， （ ）， ry ， （ ） ry ， ， ， ， ， Conclusion Key words:G

3、lycyrrhiza uralensis； ； ； ； 烏拉甘草Glycyrrhiza uralensis 為豆科甘草屬多年生草本植物 ，是中國(guó)藥典中收錄的藥用甘草之一，其性平味甘，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效 。其有效成分主要為甘草酸類和甘草黃酮類物質(zhì)。最近研究表明甘草酸還具有抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用 。本研究以人宮頸癌細(xì)胞株（ ）、人乳腺癌細(xì)胞株（ ）、人胃癌細(xì)胞株（ ）以及人肝癌細(xì)胞株（ ） 種腫瘤細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究甘草有效成分的抗腫瘤活性及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，為甘草提取物抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的研究以及甘草新藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。1 器材與方法 提取物

4、的制備 甘草酸的制備烏拉甘草的根莖采自石河子大學(xué)甘草資源圃，烘干至恒重后粉碎成粉末，過(guò) 目篩。準(zhǔn)確稱取 樣品干粉，加 蒸餾水，于室溫條件下放置 ， 離心 ，取 上清液加 甲醇混勻， 離心 ，取上清液，用孔徑為 的微孔濾膜過(guò)濾， 法測(cè)定甘草酸含量。 甘草黃酮的制備準(zhǔn)確稱取 樣品粉末，用 無(wú)水乙醇加 滴濃鹽酸為提取劑在索氏提取器中于的水浴加熱條件下提取 ，濃縮至 ，冷卻至室溫后補(bǔ)足溶劑至刻度，用孔徑 的微孔濾膜過(guò)濾，用 酚試劑法測(cè)定總黃酮含量。2 細(xì)胞株人宮頸癌細(xì)胞株（）、人乳腺癌細(xì)胞株（ ），人胃癌細(xì)胞株（ ），人肝癌細(xì)胞株（ ），均由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)提供。 設(shè)備及試劑1 儀器

5、 分析儀（）、紫外可見(jiàn)分光光度儀（上海棱光）、 培養(yǎng)箱（美國(guó)）、 自動(dòng)酶標(biāo)儀（）、熒光顯微鏡（ ）、超凈工作臺(tái)（上海凈化設(shè)備廠）、血球記數(shù)板（上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠）、倒置顯微鏡（重慶）、超速離心機(jī)。2 試劑（） 、小牛血清（杭州四季青公司）、胰蛋白酶（） 、二甲基亞砜（分析純）、甲醇（色譜純）、四噻唑藍(lán)（）、順鉑（，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）、 染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。 方法及觀察指標(biāo)1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用含滅活小牛血清的 培養(yǎng)基，置于， 孵箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，常規(guī)苔酚藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞大于。2 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)分 個(gè)濃度（ ） 、陰性對(duì)照（含同一細(xì)胞密度的培養(yǎng)液

6、）、空白對(duì)照。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（細(xì)胞密度為 × 個(gè)） 孔接種于 孔板，飽和濕度， 條件下培養(yǎng) ，待細(xì)胞均已貼壁，加入 不同濃度的受試物，各設(shè) 個(gè)復(fù)孔。在 取出 孔板，倒置顯微鏡下觀察后，每孔加 溶液（ ） ，繼續(xù)孵育 ，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入 ，振蕩 ，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收OD 值（A ），記錄結(jié)果。抑制率（） （ 給藥組A 細(xì)胞對(duì)照組A ）× 細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)在同一濃度下進(jìn)行（甘草酸 ，黃酮 ），實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照（含同一細(xì)胞密度的培養(yǎng)液）、陽(yáng)性對(duì)照（ ）、空白對(duì)照。取普通、潔凈蓋玻片于 乙醇中浸泡 ， 溶液洗滌3遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌

7、一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，使約為 滿。加入樣品，繼續(xù)培養(yǎng)，吸盡培養(yǎng)液，加入 固定液，固定 。去固定液，用 洗兩遍， 次，吸盡液體。加入 染色液，染色 。用 洗兩遍， 次。滴滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片。熒光顯微鏡下（ ， ）隨機(jī)選取 個(gè)視野拍照后計(jì)數(shù)。凋亡率（%）凋亡細(xì)胞（視野總細(xì)胞數(shù)） ×。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)所得所有數(shù)據(jù)均經(jīng) 軟件處理并對(duì)處理組間進(jìn)行單因素方差分析，P 時(shí)表示存在顯著性差異。2 結(jié)果 甘草酸體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果光鏡下觀察到，未經(jīng)任何處理的腫瘤細(xì)胞接種 后，細(xì)胞約占孔底面積的 。高劑量甘草酸處理腫瘤細(xì)胞 時(shí)，細(xì)胞數(shù)量少，間距大，多

8、數(shù)細(xì)胞體積固縮變小、失去原有腫瘤細(xì)胞形態(tài)而略呈圓形、橢圓形，說(shuō)明對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖具有顯著的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表。表1 甘草酸對(duì)4種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)（略）從表 可見(jiàn)甘草酸的抑瘤效果表現(xiàn)出濃度依賴性，與濃度呈正相關(guān)關(guān)系。高濃度甘草酸（ ）對(duì) ， 的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用， 其抑制率分別為，對(duì) 細(xì)胞增殖的抑制作用較差，抑制率僅為。 甘草黃酮體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表)。從表 中可得知，甘草黃酮處理腫瘤細(xì)胞 后，在一定濃度范圍內(nèi)（ ），其對(duì) 種腫瘤細(xì)胞的抑制率與樣本濃度大小呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即樣本濃度越低，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率越高， 劑量的甘草黃酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果最佳，其對(duì) ， ， 等 種腫瘤

9、細(xì)胞增殖的抑制率分別為，以及；在極低濃度時(shí)（ 的劑量），甘草黃酮對(duì)這 種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)明顯抑制作用。表2 甘草黃酮對(duì)4種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)（略）2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)從圖 中可以看到， 種腫瘤細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈彌散均勻狀，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核由于凋亡致使細(xì)胞核固縮成團(tuán)，在熒光下呈致密濃染或碎塊狀，顏色較正常細(xì)胞更深更亮。甘草活性成分誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表。表3 不同處理對(duì)4種腫瘤細(xì)胞凋亡的影響（略）本研究中我們以臨床常用腫瘤治療藥物順鉑做陽(yáng)性對(duì)照，從結(jié)果中我們可以看出與陰性對(duì)照組相比甘草黃酮與甘草酸均具有極顯著的誘導(dǎo) 種腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)（P），甘草黃酮能很好的誘

10、導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞（ ）、人宮頸癌細(xì)胞（）以及人肝癌細(xì)胞（ ）的凋亡，其效果均優(yōu)于等劑量的順鉑；而對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效果不及順鉑。高濃度（ ）的甘草酸只對(duì)人宮頸癌細(xì)胞（）的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)與 的順鉑相當(dāng)，對(duì)其余細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡效果均不及順鉑。圖1 陰性對(duì)照組（×400）（略）圖2 陽(yáng)性對(duì)照組（×400）（略）圖3 樣品處理組（×400）（略）3 討論細(xì)胞凋亡是一種與細(xì)胞壞死具有不同形態(tài)及生化特征，且受基因調(diào)控的主動(dòng)性細(xì)胞死亡。與誘導(dǎo)細(xì)胞壞死相比，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺死癌細(xì)胞不會(huì)引起機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng) 。因此，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)殺傷和清除腫瘤細(xì)胞，已經(jīng)成為一種篩選抗癌藥的快速

11、有效的方法。為了探討甘草活性成分甘草酸、甘草黃酮在抗腫瘤作用中的潛在治療價(jià)值，實(shí)驗(yàn)中筆者以人宮頸癌細(xì)胞（）、人乳腺癌細(xì)胞（ ）、人胃癌細(xì)胞（ ）、人肝癌細(xì)胞（ ）為研究對(duì)象，以順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照（鉑類藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性），觀察甘草酸、甘草黃酮對(duì)這種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制及其誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果顯示甘草黃酮類化合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞（）、乳腺癌細(xì)胞（ ）以及肝癌細(xì)胞（ ） 的增殖均具有顯著的抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果；甘草酸只在高濃度條件下才對(duì)人胃癌細(xì)胞（ ）顯示出較強(qiáng)的抑制增殖作用，其對(duì)胃癌細(xì)胞（ ）的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)不佳（不及順鉑），這與以往的研究結(jié)果是一致的7。綜上所述，甘草酸、甘草黃酮抑制這 種腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡的結(jié)果是相一致的；因此，甘草酸和甘草黃酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要途徑。鑒于甘草黃酮類化合物的抑瘤效果優(yōu)于甘草酸，所以在進(jìn)行甘草抗癌藥物篩選時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮甘草黃酮類物質(zhì)。【參考文獻(xiàn)】1 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)中國(guó)植物志， 卷 分冊(cè)北京：科學(xué)出版社，：2 國(guó)家藥典委員會(huì)中國(guó)藥典，部北京：化學(xué)工業(yè)出版社，：3 ， ， ， ， （中國(guó)腫瘤），（）：4 謝 彥，