烏拉甘草有效成分對人體４ 種腫瘤細胞增殖與凋亡的影響

1、烏拉甘草有效成分對人體 種腫瘤細胞增殖與凋亡的影響    Tags：烏拉 增殖 甘草 作者：馬淼 周旭莉 戶元林 肖輝 李學禹【摘要】 目的測定烏拉甘草提取物對人體 種腫瘤細胞的抑制效果。方法應用 法測定甘草水提物（甘草酸）與醇提物（總黃酮）對宮頸癌細胞株（）、乳腺癌細胞株（ ）、胃癌細胞株（ ）以及肝癌細胞株（ ）增殖的抑制作用；運用 熒光染色劑測試其誘導細胞凋亡的生物學效應。結果甘草酸的抑瘤效果表現(xiàn)出濃度依賴性，與濃度呈正相關關系。高濃度甘草酸（ ）對 ， 的增殖均有較強的抑制作用，其抑制率分別為，對 細胞增殖的抑制作用較差，抑制率僅為。在一定濃度范

2、圍內（ ），其對 種腫瘤細胞增殖的抑制率與樣本濃度大小呈負相關關系， 劑量的甘草黃酮抑制腫瘤細胞增殖的效果最佳，其對 ， ， 等 種腫瘤細胞增殖的抑制率分別為，以及。甘草酸、甘草黃酮均能有效誘導這 種腫瘤細胞發(fā)生凋亡。結論甘草酸和甘草黃酮誘導細胞凋亡是其顯著抑制腫瘤細胞增殖的重要途徑。 【關鍵詞】 烏拉甘草 甘草酸 酮 抗腫瘤 細胞凋亡Abstract:Objective Glycyrrhiza uralensis （ ：， ： ， ： ： ） Methods ， Results ， （ ） ， （ ）， ry ， （ ） ry ， ， ， ， ， Conclusion Key words:G

3、lycyrrhiza uralensis； ； ； ； 烏拉甘草Glycyrrhiza uralensis 為豆科甘草屬多年生草本植物 ，是中國藥典中收錄的藥用甘草之一，其性平味甘，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥之功效 。其有效成分主要為甘草酸類和甘草黃酮類物質。最近研究表明甘草酸還具有抑制肺癌細胞增殖的作用 。本研究以人宮頸癌細胞株（ ）、人乳腺癌細胞株（ ）、人胃癌細胞株（ ）以及人肝癌細胞株（ ） 種腫瘤細胞作為研究對象，通過體外實驗研究甘草有效成分的抗腫瘤活性及其誘導細胞凋亡的效果，為甘草提取物抗腫瘤實驗的研究以及甘草新藥的開發(fā)提供理論依據。1 器材與方法 提取物

4、的制備 甘草酸的制備烏拉甘草的根莖采自石河子大學甘草資源圃，烘干至恒重后粉碎成粉末，過 目篩。準確稱取 樣品干粉，加 蒸餾水，于室溫條件下放置 ， 離心 ，取 上清液加 甲醇混勻， 離心 ，取上清液，用孔徑為 的微孔濾膜過濾， 法測定甘草酸含量。 甘草黃酮的制備準確稱取 樣品粉末，用 無水乙醇加 滴濃鹽酸為提取劑在索氏提取器中于的水浴加熱條件下提取 ，濃縮至 ，冷卻至室溫后補足溶劑至刻度，用孔徑 的微孔濾膜過濾，用 酚試劑法測定總黃酮含量。2 細胞株人宮頸癌細胞株（）、人乳腺癌細胞株（ ），人胃癌細胞株（ ），人肝癌細胞株（ ），均由中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫提供。 設備及試劑1 儀器

5、 分析儀（）、紫外可見分光光度儀（上海棱光）、 培養(yǎng)箱（美國）、 自動酶標儀（）、熒光顯微鏡（ ）、超凈工作臺（上海凈化設備廠）、血球記數板（上海醫(yī)用光學儀器廠）、倒置顯微鏡（重慶）、超速離心機。2 試劑（） 、小牛血清（杭州四季青公司）、胰蛋白酶（） 、二甲基亞砜（分析純）、甲醇（色譜純）、四噻唑藍（）、順鉑（，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）、 染色試劑盒（碧云天生物技術研究所）。 方法及觀察指標1 細胞培養(yǎng)細胞用含滅活小牛血清的 培養(yǎng)基，置于， 孵箱中培養(yǎng)。實驗用細胞均處于對數生長期，常規(guī)苔酚藍計數活細胞大于。2 體外抗腫瘤實驗體外抗腫瘤實驗分 個濃度（ ） 、陰性對照（含同一細胞密度的培養(yǎng)液

6、）、空白對照。對數生長期細胞（細胞密度為 × 個） 孔接種于 孔板，飽和濕度， 條件下培養(yǎng) ，待細胞均已貼壁，加入 不同濃度的受試物，各設 個復孔。在 取出 孔板，倒置顯微鏡下觀察后，每孔加 溶液（ ） ，繼續(xù)孵育 ，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加入 ，振蕩 ，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收OD 值（A ），記錄結果。抑制率（） （ 給藥組A 細胞對照組A ）× 細胞凋亡率實驗細胞凋亡實驗在同一濃度下進行（甘草酸 ，黃酮 ），實驗設陰性對照（含同一細胞密度的培養(yǎng)液）、陽性對照（ ）、空白對照。取普通、潔凈蓋玻片于 乙醇中浸泡 ， 溶液洗滌3遍，再用細胞培養(yǎng)液洗滌

7、一遍。將蓋玻片置于六孔板內，種入細胞培養(yǎng)過夜，使約為 滿。加入樣品，繼續(xù)培養(yǎng)，吸盡培養(yǎng)液，加入 固定液，固定 。去固定液，用 洗兩遍， 次，吸盡液體。加入 染色液，染色 。用 洗兩遍， 次。滴滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片。熒光顯微鏡下（ ， ）隨機選取 個視野拍照后計數。凋亡率（%）凋亡細胞（視野總細胞數） ×。 統(tǒng)計學處理實驗所得所有數據均經 軟件處理并對處理組間進行單因素方差分析，P 時表示存在顯著性差異。2 結果 甘草酸體外抗腫瘤實驗結果光鏡下觀察到，未經任何處理的腫瘤細胞接種 后，細胞約占孔底面積的 。高劑量甘草酸處理腫瘤細胞 時，細胞數量少，間距大，多

8、數細胞體積固縮變小、失去原有腫瘤細胞形態(tài)而略呈圓形、橢圓形，說明對腫瘤細胞的生長與增殖具有顯著的抑制作用。結果見表。表1 甘草酸對4種腫瘤細胞增殖的抑制效應（略）從表 可見甘草酸的抑瘤效果表現(xiàn)出濃度依賴性，與濃度呈正相關關系。高濃度甘草酸（ ）對 ， 的增殖均有較強的抑制作用， 其抑制率分別為，對 細胞增殖的抑制作用較差，抑制率僅為。 甘草黃酮體外抗腫瘤實驗結果(見表)。從表 中可得知，甘草黃酮處理腫瘤細胞 后，在一定濃度范圍內（ ），其對 種腫瘤細胞的抑制率與樣本濃度大小呈負相關關系，即樣本濃度越低，對腫瘤細胞的抑制率越高， 劑量的甘草黃酮抑制腫瘤細胞增殖的效果最佳，其對 ， ， 等 種腫瘤

9、細胞增殖的抑制率分別為，以及；在極低濃度時（ 的劑量），甘草黃酮對這 種腫瘤細胞生長均無明顯抑制作用。表2 甘草黃酮對4種腫瘤細胞增殖的抑制效應（略）2.3 細胞凋亡實驗從圖 中可以看到， 種腫瘤細胞經熒光染色后，正常細胞的細胞核呈彌散均勻狀，凋亡細胞的細胞核由于凋亡致使細胞核固縮成團，在熒光下呈致密濃染或碎塊狀，顏色較正常細胞更深更亮。甘草活性成分誘導 細胞凋亡的實驗結果見表。表3 不同處理對4種腫瘤細胞凋亡的影響（略）本研究中我們以臨床常用腫瘤治療藥物順鉑做陽性對照，從結果中我們可以看出與陰性對照組相比甘草黃酮與甘草酸均具有極顯著的誘導 種腫瘤細胞凋亡的生物學效應（P），甘草黃酮能很好的誘

10、導人乳腺癌細胞（ ）、人宮頸癌細胞（）以及人肝癌細胞（ ）的凋亡，其效果均優(yōu)于等劑量的順鉑；而對胃癌細胞凋亡的誘導效果不及順鉑。高濃度（ ）的甘草酸只對人宮頸癌細胞（）的誘導凋亡效應與 的順鉑相當，對其余細胞的誘導凋亡效果均不及順鉑。圖1 陰性對照組（×400）（略）圖2 陽性對照組（×400）（略）圖3 樣品處理組（×400）（略）3 討論細胞凋亡是一種與細胞壞死具有不同形態(tài)及生化特征，且受基因調控的主動性細胞死亡。與誘導細胞壞死相比，通過誘導細胞凋亡殺死癌細胞不會引起機體強烈的炎癥反應 。因此，通過誘導細胞凋亡來殺傷和清除腫瘤細胞，已經成為一種篩選抗癌藥的快速

11、有效的方法。為了探討甘草活性成分甘草酸、甘草黃酮在抗腫瘤作用中的潛在治療價值，實驗中筆者以人宮頸癌細胞（）、人乳腺癌細胞（ ）、人胃癌細胞（ ）、人肝癌細胞（ ）為研究對象，以順鉑作為陽性對照（鉑類藥物具有較強的抗腫瘤活性），觀察甘草酸、甘草黃酮對這種腫瘤細胞的增殖抑制及其誘導凋亡作用。結果顯示甘草黃酮類化合物對人宮頸癌細胞（）、乳腺癌細胞（ ）以及肝癌細胞（ ） 的增殖均具有顯著的抑制及誘導細胞凋亡的效果；甘草酸只在高濃度條件下才對人胃癌細胞（ ）顯示出較強的抑制增殖作用，其對胃癌細胞（ ）的誘導凋亡效應不佳（不及順鉑），這與以往的研究結果是一致的7。綜上所述，甘草酸、甘草黃酮抑制這 種腫瘤細胞增殖與誘導其細胞凋亡的結果是相一致的；因此，甘草酸和甘草黃酮誘導細胞凋亡是其顯著抑制腫瘤細胞增殖的重要途徑。鑒于甘草黃酮類化合物的抑瘤效果優(yōu)于甘草酸，所以在進行甘草抗癌藥物篩選時，應優(yōu)先考慮甘草黃酮類物質?！緟⒖嘉墨I】1 中國科學院中國植物志編輯委員會中國植物志， 卷 分冊北京：科學出版社，：2 國家藥典委員會中國藥典，部北京：化學工業(yè)出版社，：3 ， ， ， ， （中國腫瘤），（）：4 謝 彥，