中藥天年飲對(duì)衰老大鼠卵巢端粒酶活性的影響

1、中藥天年飲對(duì)衰老大鼠卵巢端粒酶活性的影響                          作者：謝紅林 王陪 李皓巖 薛景鳳【摘要】  目的觀察中藥天年飲對(duì)衰老大鼠卵巢抗氧化能力和端粒酶活性的作用。方法D-半乳糖連續(xù)腹腔注射建立亞急性衰老的大鼠模型，并給予天年飲灌胃。分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法、PCR-ELISA法檢測(cè)卵巢組

2、織SOD活性、MDA含量和端粒酶活性。結(jié)果天年飲可明顯提高衰老大鼠卵巢組織SOD和端粒酶活性，降低MDA含量，天年飲用藥組與衰老模型組比較差異顯著（P0.01或P0.05）。結(jié)論中藥天年飲可提高衰老大鼠卵巢抗氧化能力和端粒酶活性，具有延緩卵巢細(xì)胞衰老的作用。 【關(guān)鍵詞】  天年飲 衰老 端粒酶 抗氧化 卵巢1988年Meites1提出，在衰老的過程中，神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌起著重要作用，而下丘腦-垂體-性腺軸（HPG軸）是其重要組成部分，研究HPG軸的衰老機(jī)制以及藥物對(duì)其調(diào)節(jié)作用已成為目前抗衰老研究的熱點(diǎn)。女性產(chǎn)生更年期癥狀的主要原因是卵巢功能減退，伴隨生殖腺衰老所發(fā)生的性激素分泌及調(diào)節(jié)

3、機(jī)制的改變不僅導(dǎo)致生殖功能的減退，同時(shí)也與衰老的各種表現(xiàn)有關(guān)2。端粒酶是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，近年的研究表明，幾乎所有的人腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到端粒酶活性，端粒酶的活性與癌的發(fā)生密切相關(guān)3。目前，在衰老及延緩衰老的研究中，端粒及端粒酶也逐漸受到重視。天年飲由劉河間宣明論方何首烏丸加味而成，能填精補(bǔ)髓、烏發(fā)延年。本課題組的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，中藥天年飲可提高衰老大鼠的免疫功能、延緩雄性大鼠性腺衰老4，5，本文觀察了天年飲對(duì)衰老雌性大鼠卵巢SOD活性、端粒酶活性及MDA含量的影響，以期為進(jìn)一步研究中藥延緩卵巢功能衰退開辟另一途徑。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組  雌性S

4、D大鼠，體重180250 g。將大鼠隨機(jī)分為4組，正常組、衰老模型組、天年飲用藥組和陰性對(duì)照組，每組16只。其中模型組、用藥組、陰性對(duì)照組大鼠均采用D-半乳糖連續(xù)腹腔注射（按200 mg/kg給藥，1次/d，連續(xù)40 d）制作亞急性衰老的動(dòng)物模型。模型組大鼠造模成功后不再做任何處理；用藥組大鼠造模成功后每天用天年飲灌胃，共30 d；陰性對(duì)照組大鼠在造模成功后每天灌胃生理鹽水，量及灌胃時(shí)間同用藥組大鼠。1.2  藥品與試劑  天年飲由炙何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓等6味中藥組成，熬制后每毫升含生藥1.5 g，按16.2 g/kg灌胃給藥。D-半乳糖(D-gal)

5、，北京化學(xué)試劑公司(批號(hào)020402)；端粒酶活性檢測(cè)試劑盒，德國(guó)Roche公司；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所。1.3  端粒酶活性的檢測(cè) 1.3.1  標(biāo)本制備各組分別隨機(jī)選取8只大鼠，斷頭處死，迅速取出雙側(cè)卵巢稱重，生理鹽水漂洗后，4，10 000 r/min離心1 min，棄上清液；將沉淀組織液氮冷凍后研磨，加入洗液洗滌，同上條件離心1 min；沉淀加入裂解液懸浮，冰浴30 min，4，13 000 r/min離心20 min，取上清液-70冰箱保存。1.3.2  檢測(cè)端粒酶活性采用德國(guó)Roche公司

6、的端粒酶活性檢測(cè)試劑盒（Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS）,按試劑盒說明進(jìn)行操作，包括端粒擴(kuò)增、雜交及ELISA檢測(cè)，分別于檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm和波長(zhǎng)690 nm處檢測(cè)吸光度，并根據(jù)下面公式結(jié)果：    RTA=(AS-ASO)AS,IS(ATS8-ATS8,O)/ATS8,IS×1001.4  卵巢組織SOD活性、MDA含量的測(cè)定取各組余下的8只大鼠，斷頭處死，迅速取雙側(cè)卵巢，稱重后加入生理鹽水冰浴下勻漿，4、10 000 0 r/min離心10 min，取上清液-70冰箱保存。分別采用黃嘌呤氧化酶法和

7、硫代巴比妥酸法按試劑盒說明進(jìn)行操作，檢測(cè)卵巢組織中的SOD活性和MDA含量。1.5  統(tǒng)計(jì)處理  采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，以方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。2  結(jié)果2.1  端粒酶活性  各組大鼠卵巢端粒酶活性見表1。衰老模型大鼠卵巢端粒酶活性明顯低于正常大鼠（P0.01）；天年飲可抑制衰老大鼠卵巢端粒酶活性的降低，天年飲用藥組大鼠端粒酶活性明顯高于衰老模型組大鼠（P0.01）。1         表1  各組大鼠卵巢端粒酶活性（略）與模型組比較，*P0.0

8、1；與天年飲用藥組比較，#P0.01；n=82.2  SOD活性和MDA含量  各組大鼠卵巢組織SOD活性和MDA含量見表2。    與正常大鼠比較，衰老模型大鼠卵巢SOD活性明顯降低、MDA含量明顯升高；中藥天年飲可提高衰老大鼠卵巢SOD活性、降低MDA含量。表2  各組大鼠卵巢組織SOD活性和MDA含量（略）與正常組比較，*P0.01；與衰老模型組比較，#P0.01，#P0.05；n=83  討論    絕經(jīng)期婦女產(chǎn)生更年期癥狀的主要原因是卵巢功能減退，失去排卵及分泌雌激素、孕激素的功能。卵

9、巢分泌激素減少，導(dǎo)致圍絕經(jīng)期中老年婦女的內(nèi)分泌、免疫功能、骨代謝、自由基代謝等的顯著改變，出現(xiàn)骨折、感染、癌癥和自身免疫性疾病的幾率增高以及老年癡呆癥發(fā)病率增加（女性發(fā)病率為男性的34倍）等臨床特征，對(duì)中老年婦女的健康造成了很大影響。機(jī)體在代謝中消耗的氧，2%5%變成活性氧，如超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等，而線粒體是產(chǎn)生活性氧的主要場(chǎng)所。在正常生理情況下，體內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)，包括SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等，還有一些抗氧化物質(zhì)VE，VC等。由于這些酶類及抗氧化物質(zhì)的存在，使體內(nèi)的活性氧處于生成與消除的平衡狀態(tài)，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。隨著年齡的增長(zhǎng)，這些抗氧化防御體系活性降低，

10、清除自由基能力下降，使體內(nèi)活性氧生成過量；過量的活性氧可以攻擊位于線粒體內(nèi)膜上的脂類、蛋白質(zhì)和mtDNA，影響線粒體的功能，導(dǎo)致細(xì)胞受損、衰老和疾病的發(fā)生6。    端粒（Telomere）是真核細(xì)胞染色體末端一段特殊的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，在維護(hù)染色體的完整性，防止染色體自身及染色體之間的融合、DNA降解、染色體缺失及抵御細(xì)胞內(nèi)各種蛋白酶對(duì)染色體末端的異常操作有重要作用，并參與染色體在細(xì)胞核內(nèi)的定位及基因表達(dá)調(diào)控7。端粒的長(zhǎng)短和穩(wěn)定性決定了細(xì)胞的壽命，并與衰老和癌變密切相關(guān)。影響端粒長(zhǎng)度的因素很多，其中端粒酶是重要的延長(zhǎng)端粒的因素，它可通過逆轉(zhuǎn)錄的方式合成染色體

11、末端DNA的重復(fù)序列，從而維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定，阻止細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生8。研究表明，活性氧不但與細(xì)胞的增殖分化有關(guān)，它還可以通過基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄控制端粒酶，使端粒酶的活性降低9；反之，端粒酶也可對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)10，二者在衰老過程中均發(fā)揮著重要作用。    天年飲由劉河間宣明論方何首烏丸加味而成。何首烏丸本由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝組成，能填精補(bǔ)髓、烏發(fā)延年；于此基礎(chǔ)上加淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)以強(qiáng)筋骨，丹參活血化瘀以通心脈，茯苓健脾利濕以寧心神。諸藥相配通調(diào)心脾肝腎四臟，而以腎為主。氣機(jī)條達(dá)，血脈流通，衰從何由。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，中藥天年飲可明顯提高衰老雌性大鼠卵巢端粒酶

12、和SOD活性、降低MDA含量，說明天年飲可提高衰老雌性大鼠卵巢的抗氧化能力及端粒酶活性，通過延緩端粒的縮短以及降低活性氧含量，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，從而達(dá)到延緩卵巢細(xì)胞衰老的作用?！尽?#160; 1 Meites J. Neuroendocrine biomarkers of aging in the ratJ.Exp Gerontol, 1988, 23(45)：349.2 Hall JE. Neuroendocrine changes with reproductive aging in womenJ.Semin Reprod Med，2007，25(5)：344.3 Telomere

13、dysfunction and telomerase activation in cancer-a pathological paradox J.Cytogenet Genome Res, 2007, 118(2-4)：270.4 陳志宏，謝紅林，郭 森，等.中藥天年飲對(duì)衰老大鼠免疫功能的影響J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（6）：1300.5 陳志宏，高福祿，龐曉靜，等. 天年飲對(duì)亞急性衰老大鼠睪丸生精細(xì)胞增殖與凋亡的影響J.老年學(xué)雜志，2004，24（4）：347.6 St-Pierre J, Buckinghan JA, Roebuck SJ, et al. Topology of su

14、peroxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chainJ.J Biol Chem, 2002,277(47):44784.7 Zhang TC, Schmitt MT, Mumford JL. Effects of arsenic on telomerase and telomeres in relation to cell proliferation and apoptosis in human keratinocytes and leukemia cells in vitr

15、oJ.Carcinogenesis, 2003,24(11)：1811.8 Song JS, Kim HP, Yoon WS, et al. Adenovirus-mediated suicide gene therapy using the human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter induced apoptosis of ovarian cancer cell lineJ.Biosci Biotechnol Biochem, 2003,67(11)：2344.9 Dennery PA.Effects of oxidative stress on embryoni