二氮嗪對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響(一)

1、二氮嗪對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響(一)    作者：沈誠，范士志，陳建明，李志平，李寒 【摘要】 目的研究二氮嗪(DZ)開放線粒體ATP敏感性鉀通道對缺血再灌注損傷所致大鼠心肌組織ICAM-1和TNF- 表達的影響。方法采用離體工作心臟灌注模型,大鼠隨機分為正常對照組，缺血再灌注組，DZ治療組, DZ抑制劑-格列苯脲組。采用RT-PCR法測定心肌ICAM-1mRNA表達,ELISA檢測試劑盒檢測TNF- 蛋白含量。結(jié)果與正常對照組相比, 心肌組織ICAM-1表達和TNF- 含量在缺血再灌注后有顯著性增加(P0.01)。DZ處理后, ICAM-1表達和

2、TNF- 含量與缺血再灌注組相比有明顯下降(P0.05); 格列苯脲組ICAM-1表達和TNF- 含量明顯高于DZ治療組(P0.05)。結(jié)論心肌缺血再灌注損傷使ICAM-1和TNF- 表達明顯升高, 二氮嗪(DZ)開放線粒體ATP敏感性鉀通道可下調(diào)心肌組織ICAM-1和TNF- 的表達,這可能有助于減輕缺血再灌注所致心肌損傷。 【關(guān)鍵詞】 ATP敏感性鉀通道；缺血再灌注； ICAM-1； TNF- The Effect of Diazoxide on Ischemia-Reperfusion Injury in Rat Cardiac MusclesAbstract: OBJECTIVE To

3、 investigate the effect of diazoxide on expression of ICAM-1 and TNF- during ischemia-reperfusion in rat cardiac muscles. METHODS Using isolated rat heart model, 40 male SD rats were randomly divided into normal control group(n=10), ischemia-reperfusion group(n=10), diazoxide treatment group(n=10)an

4、d diazoxide inhibitor group(n=10).The expression of ICAM-1mRNA was extracted and measured by RT-PCR. TNF level in the myocardium were measured using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) system. RESULTSThe expression of ICAM-1mRNA significantly increased after ischemia-reperfusion and TNF- levels

5、 had the same change. treatment with diazoxide significantly inhibited the expression of ICAM-1mRNA, and concomitantly decreased the level of TNF- in the myocardium. The diazoxide inhibitor can significantly increase the expression of ICAM-1mRNA and the level of TNF- . CONCLUSIONThese data suggest t

6、hat myocardial ischemia-reperfusion can result in intensive activation of ICAM-1 and TNF- . Early treatment with diazoxide might be benefit for attenuation of myocardial injury induced by ischemia-reperfusion.Key words：KATP; Ischemia-reperfusion; ICAM-1; TNF- 心肌缺血再灌注損傷是阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要原因。近年發(fā)現(xiàn),

7、腫瘤壞死因子(TNF- )、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)參與了心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展,其作用越來越受到重視。心肌ATP敏感鉀離子通道（ATP-sensitive potassium channel KATP）是心肌細胞內(nèi)一種可被細胞內(nèi)ATP和其他腺嘌呤核苷酸抑制的內(nèi)向整流K+通道，可調(diào)節(jié)正常心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能。缺血再灌注損傷中，線粒體KATP與TNF- 和ICAM-1表達關(guān)系的研究目前尚為缺乏。本文采用離體大鼠心臟灌注模型,通過研究開放線粒體KATP對缺血再灌注損傷心肌TNF- 和ICAM-1表達的影響,探討減少心肌缺血再灌注損傷的有效途徑。1材料與方法1.1動物分組40只雄

8、性清潔級SD大鼠,體重200 250 ,隨機分為4組。A組，即正常對照組(10只),麻醉后切開胸腔取正常心肌；B組，即缺血再灌注組(10只), 取心臟，建立離體灌注模型；Krebs-Henseleit緩沖液預(yù)灌注15 min，待心臟穩(wěn)定搏動后，給予常規(guī)含鉀停搏液灌注，33停灌30min，復(fù)灌30 min；C組，即二氮嗪治療組(DZ組,10只), 取心臟，建立離體灌注模型；待心臟穩(wěn)定搏動后，給予常規(guī)含鉀停搏液+ DZ灌注，33停灌30min，復(fù)灌30 min。D組，即二氮嗪抑制劑格列苯脲組(格列苯脲組,10只), 取心臟，建立離體灌注模型；待心臟穩(wěn)定搏動后，給予常規(guī)含鉀停搏液+ 格列苯脲灌注，3

9、3停灌30 min，復(fù)灌30 min。1.2離體工作心臟灌注模型動物充分麻醉后，置于動物臺上并固定。剪開腹部皮膚，沿腹白線開腹，至劍突。提出腸道置于一側(cè)，暴露下腔靜脈，按3 mg/Kg經(jīng)下腔靜脈注射肝素生理鹽水。1 min后充分肝素化，剪開腹腔血管放血。迅速開胸，剪去胸腺組織，充分暴露心臟及大血管。游離主動脈至無名動脈遠端，并剪斷，迅速將其余大血管一并結(jié)扎并剪斷，取出心臟，置于4K-H液中簡單修剪。開啟離體心臟灌注系統(tǒng)，流量約15 ml/min。顯微器械提起主動脈，將灌注管道插入，置于主動脈瓣及冠狀動脈開口上方，打結(jié)固定，開始灌注，心臟迅速恢復(fù)搏動。在肺動脈圓錐處剪一小口，使冠脈流出液自然流出

10、。剪開左心耳，將左心室測壓管經(jīng)切口、左心房、二尖瓣插入，并將另一連于灌輸瓶的灌注管插入左心房，打結(jié)固定。連接各測壓管道并調(diào)零，開始測壓。調(diào)整離體心臟灌注系統(tǒng)轉(zhuǎn)速及流量，使主動脈根部壓力約80 cmH2O，而灌注瓶與左心房落差約20 cm，相當于左心室前負荷為20 cmH2O，后負荷為80 mm Hg。心臟持續(xù)穩(wěn)定搏動。待心臟穩(wěn)定搏動15 min后，關(guān)閉灌注系統(tǒng)，心臟逐漸停搏。心肌缺血30 min。重新開啟關(guān)注系統(tǒng)，心臟迅速恢復(fù)搏動，起初心率較慢，搏動不穩(wěn)定，2 min3 min后逐漸恢復(fù)。檢測指標及方法(1)采用RT-PCR法檢測ICAM-1mRNA表達：秤取心肌組織約150 mg ，以異硫氰

11、酸胍一步法提取細胞總RNA。采用RT-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增,以-actin作為內(nèi)參對照。大鼠ICAM-1序列(擴增片段為590 bp):5, -AGGTGTGATATCCGGTAGA -3,(上游)；5, - CCTTCTAAGTGGTTGGAACA -3,(下游); -actin序列 (擴增片段為180 bp):5, -ATCGTGCGGGACATCAAGG -3,(上游);5, - CAGGAAGGAGGGCTGGAACA -3,(下游)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,電泳凝膠置于GDS8000凝膠成像系統(tǒng)，PCR產(chǎn)物量以光密度×面積表示。記錄各條帶積分光密度(IOD

12、)，將檢測基因與自身-actin條帶IOD相比較得到其相對IOD。(2)心肌組織中TNF-含量測定(ELISA):取0.05g的心肌組織,用磷酸鹽緩沖液(PH7.4)在4條件下勻漿,再離心20 min,轉(zhuǎn)速1 200 rpm,取上清液用于TNF-測定,根據(jù)試劑盒中提供的步聚操作,測出TNF-的濃度。1.3統(tǒng)計學(xué)處理各項均數(shù)±標準差( ±s )表示,并用SPSS軟件行單因素方差分析和t檢驗,P0.05表明差異有顯著性。2結(jié)果2.1各組心肌ICAM-1表達的變化A組正常心肌組織ICAM-1的表達均較微弱；而缺血再灌注后B組可見到ICAM-1表達較A組顯著增高（P0.01 ）。C

13、組給予DZ處理心肌ICAM-1含量較B組也有明顯降低（P0.05），但仍明顯高于正常，D組ICAM-1含量明顯高于C組（P0.05），但仍低于B組（P0.05），見表1。2.2各組心肌TNF-含量變化A組正常心肌TNF-含量較低，缺血再灌注后B組TNF-含量則明顯增高，與A組比較有顯著性差異（P0.01）。C組給予DZ處理心肌TNF-含量雖然仍明顯高于正常，但較B組也有明顯降低（P0.05），相反D組TNF-含量與B組無顯著差異，明顯高于C組（P0.05），見表1。表1大鼠心肌組織ICAM-1表達和TNF-含量（略）注：與正常對照組（A組）比較 ：*P0.01；與缺血再灌注組（B組）比較：P0

14、.05；與二氮嗪治療組（C組）比較 ：* *P0.053討論線粒體KATP是包括一個55KDa內(nèi)向K+通道和一個63KDa磺脲類受體異源多聚體，當線粒體基質(zhì)ATP不足時,此通道開放,線粒體產(chǎn)生內(nèi)向K+電流,線粒體基質(zhì)體積短時增大,呼吸鏈活性顯著增強。二氮嗪是線粒體KATP通道的特異性開放劑，對線粒體上的KATP作用強大而對胞膜的KATP作用相對較弱。Marina等1以離體小鼠心臟實驗,缺血25min再灌注30min，發(fā)現(xiàn)二氮嗪能推遲心臟攣縮的開始,促進缺血后功能恢復(fù)。Beresewicz等2證實以二氮嗪開放線粒體KATP對缺血心肌具有保護作用。同時亦有實驗證實，心肌缺血預(yù)適應(yīng)對心肌的保護也由線

15、粒體KATP介導(dǎo)。TNF-是一種自分泌的作用因子，在缺血再灌注損傷中參與了心肌損傷的形成和發(fā)展，其表達水平在缺血再灌注時增高，促進了白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附和相互作用，使粒細胞向缺血再灌注區(qū)域的浸潤大大增加，從而導(dǎo)致心肌損害3。ICAM-1作為白細胞功能相關(guān)抗原、巨噬細胞分化抗原-1的配體,參與白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附并向血管外遷移,黏附心肌細胞釋放細胞毒, 表達增強的ICAM-1還可反饋作用于內(nèi)皮細胞、巨噬細胞，促進細胞因子的炎癥介質(zhì)的表達。ICAM-1在內(nèi)皮及心肌細胞中的誘生對中性白細胞介導(dǎo)的缺血再灌注損傷至關(guān)重要4。國外研究發(fā)現(xiàn), 心臟缺血再灌注損傷中ICAM-1表達明顯升高, 且與心肌

16、損傷密切相關(guān)5。本實驗數(shù)據(jù)表明，缺血再灌注損傷模型中TNF-, ICAM-1含量明顯增加。二氮嗪治療組下調(diào)心肌組織中TNF-, ICAM-1水平,保護心肌。同時，應(yīng)用格列苯脲可減少二氮嗪的這種保護作用。由此證明開放線粒體KATP通道可抑制心肌缺血再灌注時內(nèi)皮細胞合成釋放細胞因子等炎癥介質(zhì)，減輕心肌損傷?？傮w來看，通過開放線粒體KATP而減少心肌TNF- 和ICAM-1表達能夠減輕缺血再灌注損傷并有效防止心肌缺血再灌注引起的炎性反應(yīng)。本實驗結(jié)果為臨床防止缺血再灌注損傷提供了一個新的思路,其確切臨床價值有待于進一步的研究和證實?！緟⒖嘉墨I】1Marina-Prendes MG, Rastelli

17、AH, Astudilla C, et al. Influence of fasting on the effects of diazoxide in the ischemic-reperfused rat heartJ. J Physiol Biochem,2004,60(1): 51-58.2Beresewicz A, Maczewski M, Duda M, et al. Effect of classic preconditioning and diazoxide on endothelial function and O2- and NO generation in the post

18、-ischemic guinea-pig heartJ. Cardiovasc Res,2004,63(1): 118-129.3Sugano M, Hata T, Tsuchida K, et al. Local delivery of soluble TNF-alpha receptor 1 gene reduces infarct size following ischemia/reperfusion injury in ratsJ. Mol Cell Biochem,2004, 266(1-2): 127-132.4Merchant SH, Gurule DM, Larson RS, et al. Amelioration of ischemia-reperfusion injury with cyclic peptide blockade of ICAM-1J. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,284(4): H1260-126