色譜峰色譜柱及參數(shù)

1、死時(shí)間(dead time，t0)-不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測(cè)定死時(shí)間。死體積(dead volume，V0)-由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0F×t0（F為流速）梯度方法的建立：Rs：分離度，表示兩峰分離程度的物理量。k：容量因子，表示某溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中物質(zhì)的量的比，在等度洗脫中。一種物

2、質(zhì)的k值是恒定不變的。上面兩試針對(duì)的是梯度洗脫，表示的平均容量因子。a：分離因子，兩個(gè)溶質(zhì)的容量因子的比。通常k大的作為分子。表示兩物質(zhì)分離能力的大小。N：理論塔板數(shù)，表示柱子的分離能力，也就是柱效。：梯度時(shí)間；F：流速；：死體積；：梯度變化范圍。常見問題和維護(hù)：整個(gè)液相系統(tǒng)最值得關(guān)注的常數(shù)：壓力除體系受到污染之外，幾乎所有柱前的問題都能在壓力變化上表現(xiàn)出來。壓力來源：泵上的壓力傳感器最常見的問題：壓力?。◣缀鯙榱悖赫f明沒有流動(dòng)相流過柱子。可能原因：柱前漏夜流速設(shè)為0了流動(dòng)相干了吸濾頭沒有放流動(dòng)相液面之下流路中有大段氣泡處理方法：漏液：從泵的出口到柱子的前端接口（柱后漏液幾乎不會(huì)影響壓力值）

3、順次檢查。泵上有自己的漏液傳感器。檢測(cè)到漏液。會(huì)停止工作并蜂鳴，變紅。同時(shí)顯示錯(cuò)誤信息：ERROR：LEAK DETECTED。發(fā)現(xiàn)漏液點(diǎn)，先停泵，重新接好。將漏液擦干。有的漏液不明顯，這時(shí)壓力的也不會(huì)太小，檢查時(shí)要注意，可用手仔細(xì)摸各個(gè)接口，感覺是否濕冷。流路中有大段氣泡：通過大流速（如5ml/min）沖洗可以去除泵體內(nèi)氣泡。也就是常說的PURGE。按下泵的面板上的purge鍵即可。每次PURGE的時(shí)間和流速可以在面板上設(shè)定。通常不改。初始值應(yīng)該是5ml/min，3min。但有時(shí)候泵體內(nèi)空氣太多，purge都不可以，或者很難抽上流動(dòng)相，這是可以在purge的同時(shí)，用注射器，在泵的廢液出口處抽

4、。直到?jīng)]有氣泡。關(guān)于偶爾出現(xiàn)的氣泡，不用太過在意，因?yàn)椋?. 有脫氣機(jī)在。2. 在purge時(shí)，由于流速太大，難免會(huì)出現(xiàn)氣泡。尤其是在purge閥開超過180度，廢液出口處出現(xiàn)氣泡就跟平常了。3. 只要?dú)馀莶辉诒们粌?nèi)堆積，就幾乎不會(huì)影響到分析結(jié)果。只要出了泵口，在高壓下會(huì)被壓縮的很小。不影響流路的延續(xù)性。所以，只要觀察壓力變化，如果壓力沒有異常波動(dòng)，就行。在泵體內(nèi)有氣泡堆積時(shí)，壓力波動(dòng)會(huì)變大。什么樣的波動(dòng)算正常，需要大家注意觀察。根究經(jīng)驗(yàn)，在以恒定流速，梯度不變時(shí)，面板上以MP為單位的顯示值應(yīng)該幾乎不變。頻繁出現(xiàn)的氣泡會(huì)影響到流路的延續(xù)性，應(yīng)該注意。吸濾頭堵，管路臟（通常是水相）有可能帶來頻繁

5、出現(xiàn)的氣泡。可以先A，B的溶劑瓶調(diào)換一下。PURGE三五次。后換回來，再PURGE兩次。清洗一下管路。壓力過大：說明流路堵了逐段排查，先從柱（預(yù)柱）前接口（因?yàn)橹幼钜锥拢嚅_，以一定流速走：壓力正常，說明是柱子及其后的某一段堵了（通常是柱子）。換柱子（或預(yù)柱）。壓力還高：說明是柱前某段堵了。這時(shí)再將進(jìn)樣器出口（接柱子）的peek管接頭擰下：壓力正常：說明是這段peek管堵了。換peek管。壓力還高：說明是進(jìn)樣器之前的部分堵了。通常是進(jìn)樣器六通閥堵了。反沖或清洗流通閥。其它部分依次類推。壓力波動(dòng)大：說明流路中的液流不平穩(wěn)，這時(shí)色譜圖通常保留時(shí)間不穩(wěn)定，峰型也不好。得到的線性，重復(fù)性也不會(huì)好。可

6、能原因：泵體內(nèi)有氣泡，泵頭單向閥壞。先確認(rèn)是哪一臺(tái)泵有問題。先走100%A相?？词欠駢毫€是波動(dòng)大，還大則說明A泵有問題。壓力正常則說明A泵正常。再走100%的B相，過程如上。確認(rèn)好泵之后，先purge一下，以驅(qū)趕氣泡。Purge兩次后，還是壓力波動(dòng)大，這有可能單向閥壞了，需要清洗或更換。Ctc自動(dòng)進(jìn)樣器的常用維護(hù)操作（實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)操作）：換針：調(diào)針位：調(diào)針位：設(shè)定洗針體積：一些小概念：PEEK：聚醚醚酮色譜管道，外徑多為1/16inch，1inch=2.54cm，1/16in=2.54cm，內(nèi)徑大小以顏色標(biāo)準(zhǔn)，紅色（我們用的）最小，為0.13mm（應(yīng)該是國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)）PEEK接頭手緊即可不銹鋼

7、接頭要用工具緊接頭分一體的和分為主體和壓緊環(huán)兩部分的。后者在擰緊的過程中，不易帶動(dòng)管道扭曲變形。不銹鋼的壓緊環(huán)是一次性的單位換算：1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psiPsi：pound per square inch (psi)Torr：托里徹利，標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的1/760。也就是mmHg（毫米汞柱） 其它問題：殘留大：很可能是洗針過程有問題，注意觀洗針時(shí)有沒有抽上液體，抽上來的液體是否有很多氣泡。出現(xiàn)過由于轉(zhuǎn)子磨損，洗針液不能順暢流出進(jìn)樣口。造成洗針不充分。清洗或更換轉(zhuǎn)子。也可能進(jìn)樣過程有問題，注意觀察進(jìn)樣針活塞是否推到底。可能由于流通閥堵塞，造成壓力大，進(jìn)樣針沒法推到底。

8、重現(xiàn)性不好：內(nèi)標(biāo)波動(dòng)大，可能噴霧針臟了，使得噴霧不均勻?？赡苁且合喾椒]有開發(fā)好。峰型差，峰太寬都有可能造成面積不重復(fù)（不會(huì)差別太大）。注意觀察重現(xiàn)性不好的那幾針，是否峰型比較特殊，保留時(shí)間也有較大變化，如果是，很有可能是由于pump里進(jìn)了氣泡，造成流速不穩(wěn)，這點(diǎn)可以從壓力變化得到確認(rèn)，但是好像沒法記錄壓力曲線。質(zhì)譜檢測(cè)器的色譜圖：chromatogram，強(qiáng)度和時(shí)間的圖。等同于紫外檢測(cè)的色譜圖。質(zhì)譜檢測(cè)器的光譜圖：spectrum，某一時(shí)間點(diǎn)（段時(shí)間內(nèi)平均）的強(qiáng)度相對(duì)質(zhì)荷比的圖下圖上半為一色譜圖，下半部為圖是灰色方塊（2.5min左右）內(nèi)，平均強(qiáng)度相對(duì)質(zhì)荷比的光譜圖。類似于紫外中的全波長(zhǎng)圖。分辨率：unit分辨率定義為半峰寬為0.7。其意義如下：=WW=1.70=0.7則W=0.7*1.70=1.19差不多剛好實(shí)現(xiàn)單位質(zhì)荷比的分離線性范圍：信號(hào)強(qiáng)度與樣品濃度的關(guān)系可用如下關(guān)系式表示：R=AR